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BioXL禽流感病毒H1- H15通用型PCR检测试剂盒说明书

放大字体缩小字体发布日期:2009-03-04
核心提示:【试剂盒组成】 25 管 扩增反应试剂球 (Reagent Sphere; 4℃ 保存) 2 x 520 l AIV 扩增反应试剂球溶液 (Sphere Diluent; -20℃ 保存) 2 x 25 l 阳性对照 (Positive control; -20℃ 保存) 【保存条件】 试剂球需置干燥剂中保存在4℃,已融解的试剂球则需保存在零下20℃


【试剂盒组成】
25 管 扩增反应试剂球 (Reagent Sphere; 4℃ 保存)
2 x 520 μl AIV 扩增反应试剂球溶液 (Sphere Diluent; -20℃ 保存)
2 x 25 μl 阳性对照 (Positive control; -20℃ 保存)

【保存条件】
试剂球需置干燥剂中保存在4℃,已融解的试剂球则需保存在零下20℃。其他试剂亦需保存在零下20℃。使用前在冰上溶解各试剂并充分混合,不要旋涡振荡含酶的扩增反应试剂。

【操作程序】
1 样本采集、存放及运输
1.1 样本采集:
所用取样器材必须经高压或干热灭菌。
若样品为活禽,建议取咽喉拭子和泄殖腔拭子:取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮几次取咽喉分泌液,取泄殖腔拭子时将拭子深入泻殖腔转一圈沾取粪便。然后将拭子一起放入盛有2ml PBS(含抗菌素)的试管,充分洗涤拭子,然后在管壁挤干液体,转入无菌离心管中备用。
若样品为新鲜肌肉或脏器,取待检样品2g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨,加10ml PBS混匀,取上清转入无菌离心管中备用。为使样品的代表性更强,也可取50克肉样,加入50ml无菌的PBS液,用Bagmixer均质器处理后,取上清备用。
若样品为血清、血浆或冷冻组织渗出液,则直接取用。
1.2 存放:
分离后的样本在2℃—8℃条件下保存应不超过24hr; -70℃以下可长期保存,但应避免反复冻融(最多冻融3次)。
1.3 运输:
采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。
2 样本处理:
2.1 取n个1.5ml灭菌离心管(n = 样本数+ 1管阴性对照+ 1管阳性对照),作好标记。
2.2 首先加入600ul裂解液(裂解液即提取液,有很强的腐蚀性,切勿沾到皮肤或衣物,否则立即用大量清水冲洗并擦干),然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200ul(一份样本换用一个吸头);再加入200ul氯仿,混匀器上振荡混匀5sec(不宜过于强烈,以免产生乳化层,也可用手颠倒混匀)。
2.3 于12,000g离心15min(如有条件,于4℃进行离心)。
2.4 取与步骤2.1.1中相同数量的1.5ml灭菌离心管,加入400ul异丙醇(-20℃预冷),作好标记。吸取步骤2.1.3各管中的上清液相转移至相应的管中(上清液应至少吸取500ul,注意不要吸出中间层,该层富含DNA和蛋白质),颠倒混匀。
2.5 12,000g离心15min,(注意固定离心管方向,即将离心管开口朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干);加入600ul 75%乙醇(-20℃预冷),颠倒洗涤。
2.6 12,000g离心10min,(注意固定离心管方向,即将离心管开口朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清,倒置于吸水纸上,尽量沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干)。
2.7 4,000g离心10sec(注意固定离心管方向,即将离心管开口朝离心机转轴方向放置)将管壁上的残余液体甩到管底部,用微量加样器尽量将其吸干(一份样本换用一个吸头,注意吸头不要碰到有沉淀一面),室温干燥5-10min(不宜过于干燥,以免RNA不溶)。
2.8 加入11ul DEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2,000g离心5sec,冰上保存备用(注意:此时的RNA最易受RNA酶降解,请在2小时内进行PCR扩增)。

3 扩增反应试剂的准备:
3.1 计算所需的反应数量 (n)
3.2 需要溶解的试剂球 = 0.5 x n
3.3 每个试剂球需要 40 μl 试剂球溶液

3.4 在冰上溶解试剂,并轻轻扣击充分混合 (不要旋涡振荡含酶的试剂)

4 反应的准备
4.1 实验中除从样本中获得的RNA 模板外,我们还建议设置阳性和阴性(水)对照
4.2 按照下表准备扩增反应试剂:
反应组分--每个反应体积
扩增反应试剂 20 μl
样品RNA 5 μl
总体积 25 μl
注意:实验时 RNA 应放在冰上,阳性对照建议加5 μl 试剂盒提供的阳性对照。建议PCR 过程中检测样本设置重复,以便得到可靠的实验结果。为了验证阴性实验结果不是由于样本中存有PCR 抑制物而导致PCR 呈阴性反应,我们建议在测试样本中加1 μl 的阳性对照作为spiking 对照(spiking control),同时进行PCR 反应。
PCR 循环:
1 个循环 42℃ 30 分钟
95℃ 10 分钟
40 个循环 95℃ 30 秒
53℃ 30 秒
72℃ 30 秒

5 实验数据分析
PCR 的产物需要通过琼脂糖凝胶电泳检测。
产物长度 : 246 bp
Spiking 对照阴性的实验结果有几个可能性: 样本中不存在目的片段;样本中目的片段的量低于检测值;
【样本中存有 PCR 抑制物】
试剂盒中设计spiking 对照 (spiking control) 是为了确定没有发生PCR 抑制。如果样本中加了阳性对照以后得出阴性结果,说明样本中存在PCR 抑制物,那幺此次阴性的实验结果就不能作为正确的结果,需要重新开始样本核酸的提取和PCR 扩增。

备注:
对于禽流感检测样本的获得和前处理,可以参照国家标准“高致病性禽流感诊断技术(GB/T 18936-2003)”推荐的方法进行,具体为:
【病料的采集】死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织样品,进行分别处理或者同时处理;活禽病料应包括气管或泄殖腔拭子,尤其以采集气管拭子更好;小珍禽用拭子取样易造成损伤,可采集新鲜新鲜粪便。

【病料的保存】病料应放在含有抗菌素的pH值7.0~7.4的等渗磷酸盐缓冲液(PBS)内(无PBS可用25%~50%的甘油盐水)。抗生素的选择视当地情况而定,组织和气管拭子悬液中应含有青霉素(2000IU/ml)、链霉素(2mg/ml)、庆大霉素(50?g/ml)和制霉菌素(1000IU/ml),但粪便和泄殖腔拭子所有的抗生素浓度应提高5倍,加入抗生素后pH值应调至7.0~7.4。在室温放置1h~2h后样品应尽快处理,没有条件的可在4℃存放几天,也可于低温条件下保存(-70℃贮存最好)。

【病料的处理】将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子;粪便、研碎的组织用含抗生素的pH值7.0~7.4的等渗PBS溶液配成10%~20%(g/ml)的悬液,样品液经1000r/min离心10min,取上清液作为实验材料。

【病料保存样本保存和运送的一般原则是什么】
一般性原则:采集和运输:
标本采集用材料,如棉签和拭子都应一次性使用,所使用的抗腐剂和抗凝剂不应对样本和扩增反应有降解或抑制作用。
对于RNA样本,要特别注意混入操作人员的毛发、表皮细胞和痰液。
对于DNA样本的运送:可在室温下运送,建议在8小时内完成,对RNA,10分钟内的运输可在室温进行,超过此时间,必须加冰运输,既便低温,一般亦不得超过4小时。
标本的保存:对DNA:2℃-8℃可稳定放置3天,RNA一律-20℃保存。
主要的扩增反应抑制物质:血样中用于抗凝的肝素,可以枸橼酸钠或EDTA-K3替代;血红蛋白、乳铁蛋白
【口腔棉签拭子和泻殖腔样品如何保存】
口腔棉签拭子和泻殖腔样本一般不单独保存,在取样后,应尽快将其放入含PBS缓冲液(有时要加入抗生素)的离心管充分捻动,拧干后立即进行处理和使用,不立即使用时,推荐-70℃低温保存。如果暂时不处理,也可将拭子留于离心管中低温保存。

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编辑:foodadmin

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