【试剂盒组成】
25 管 扩增反应试剂球 (Reagent Sphere; 4℃ 保存)
2 x 520 μl AIV 扩增反应试剂球溶液 (Sphere Diluent; -20℃ 保存)
2 x 25 μl 阳性对照 (Positive control; -20℃ 保存)

【保存条件】
试剂球需置干燥剂中保存在4℃，已融解的试剂球则需保存在零下20℃。其他试剂亦需保存在零下20℃。使用前在冰上溶解各试剂并充分混合，不要旋涡振荡含酶的扩增反应试剂。

【操作程序】
1 样本采集、存放及运输
1.1 样本采集：
所用取样器材必须经高压或干热灭菌。
若样品为活禽，建议取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮几次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子时将拭子深入泻殖腔转一圈沾取粪便。然后将拭子一起放入盛有2ml PBS（含抗菌素）的试管，充分洗涤拭子，然后在管壁挤干液体，转入无菌离心管中备用。
若样品为新鲜肌肉或脏器，取待检样品2g于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10ml PBS混匀，取上清转入无菌离心管中备用。为使样品的代表性更强，也可取50克肉样，加入50ml无菌的PBS液，用Bagmixer均质器处理后，取上清备用。
若样品为血清、血浆或冷冻组织渗出液，则直接取用。
1.2 存放：
分离后的样本在2℃—8℃条件下保存应不超过24hr； -70℃以下可长期保存，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。
1.3 运输：
采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。
2 样本处理：
2.1 取n个1.5ml灭菌离心管（n = 样本数+ 1管阴性对照+ 1管阳性对照），作好标记。
2.2 首先加入600ul裂解液（裂解液即提取液，有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干），然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200ul（一份样本换用一个吸头）；再加入200ul氯仿，混匀器上振荡混匀5sec（不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀）。
2.3 于12,000g离心15min（如有条件，于4℃进行离心）。
2.4 取与步骤2.1.1中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400ul异丙醇（－20℃预冷），作好标记。吸取步骤2.1.3各管中的上清液相转移至相应的管中（上清液应至少吸取500ul，注意不要吸出中间层，该层富含DNA和蛋白质），颠倒混匀。
2.5 12,000g离心15min，（注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）；加入600ul 75%乙醇（－20℃预冷），颠倒洗涤。
2.6 12,000g离心10min，（注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）。
2.7 4,000g离心10sec（注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机转轴方向放置）将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干（一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面），室温干燥5-10min（不宜过于干燥，以免RNA不溶）。
2.8 加入11ul DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000g离心5sec，冰上保存备用（注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增）。

3 扩增反应试剂的准备：
3.1 计算所需的反应数量 (n)
3.2 需要溶解的试剂球 = 0.5 x n
3.3 每个试剂球需要 40 μl 试剂球溶液

3.4 在冰上溶解试剂，并轻轻扣击充分混合 (不要旋涡振荡含酶的试剂)

4 反应的准备
4.1 实验中除从样本中获得的RNA 模板外，我们还建议设置阳性和阴性（水）对照
4.2 按照下表准备扩增反应试剂：
反应组分--每个反应体积
扩增反应试剂 20 μl
样品RNA 5 μl
总体积 25 μl
注意:实验时 RNA 应放在冰上，阳性对照建议加5 μl 试剂盒提供的阳性对照。建议PCR 过程中检测样本设置重复，以便得到可靠的实验结果。为了验证阴性实验结果不是由于样本中存有PCR 抑制物而导致PCR 呈阴性反应，我们建议在测试样本中加1 μl 的阳性对照作为spiking 对照(spiking control)，同时进行PCR 反应。
PCR 循环:
1 个循环 42℃ 30 分钟
95℃ 10 分钟
40 个循环 95℃ 30 秒
53℃ 30 秒
72℃ 30 秒

5 实验数据分析
PCR 的产物需要通过琼脂糖凝胶电泳检测。
产物长度 : 246 bp
Spiking 对照阴性的实验结果有几个可能性： 样本中不存在目的片段；样本中目的片段的量低于检测值；
【样本中存有 PCR 抑制物】
试剂盒中设计spiking 对照 (spiking control) 是为了确定没有发生PCR 抑制。如果样本中加了阳性对照以后得出阴性结果，说明样本中存在PCR 抑制物，那幺此次阴性的实验结果就不能作为正确的结果，需要重新开始样本核酸的提取和PCR 扩增。

备注：
对于禽流感检测样本的获得和前处理，可以参照国家标准“高致病性禽流感诊断技术（GB/T 18936-2003）”推荐的方法进行，具体为：
【病料的采集】死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织样品，进行分别处理或者同时处理；活禽病料应包括气管或泄殖腔拭子，尤其以采集气管拭子更好；小珍禽用拭子取样易造成损伤，可采集新鲜新鲜粪便。

【病料的保存】病料应放在含有抗菌素的pH值7.0～7.4的等渗磷酸盐缓冲液（PBS）内（无PBS可用25％～50％的甘油盐水）。抗生素的选择视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中应含有青霉素（2000IU/ml）、链霉素（2mg/ml）、庆大霉素（50?g/ml）和制霉菌素（1000IU/ml），但粪便和泄殖腔拭子所有的抗生素浓度应提高5倍，加入抗生素后pH值应调至7.0～7.4。在室温放置1h～2h后样品应尽快处理，没有条件的可在4℃存放几天，也可于低温条件下保存（-70℃贮存最好）。

【病料的处理】将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子；粪便、研碎的组织用含抗生素的pH值7.0～7.4的等渗PBS溶液配成10％～20％（g/ml）的悬液，样品液经1000r/min离心10min，取上清液作为实验材料。

【病料保存样本保存和运送的一般原则是什么】
一般性原则：采集和运输：
标本采集用材料，如棉签和拭子都应一次性使用，所使用的抗腐剂和抗凝剂不应对样本和扩增反应有降解或抑制作用。
对于RNA样本，要特别注意混入操作人员的毛发、表皮细胞和痰液。
对于DNA样本的运送：可在室温下运送，建议在8小时内完成，对RNA，10分钟内的运输可在室温进行，超过此时间，必须加冰运输，既便低温，一般亦不得超过4小时。
标本的保存：对DNA：2℃－8℃可稳定放置3天，RNA一律－20℃保存。
主要的扩增反应抑制物质：血样中用于抗凝的肝素，可以枸橼酸钠或EDTA-K3替代；血红蛋白、乳铁蛋白
【口腔棉签拭子和泻殖腔样品如何保存】
口腔棉签拭子和泻殖腔样本一般不单独保存，在取样后，应尽快将其放入含PBS缓冲液（有时要加入抗生素）的离心管充分捻动，拧干后立即进行处理和使用，不立即使用时，推荐-70℃低温保存。如果暂时不处理，也可将拭子留于离心管中低温保存。

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