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PCR产物及凝胶回收试剂盒--MagExtractor?-PCR & Gel Clean u

放大字体缩小字体发布日期:2006-05-22 浏览次数: 1500
      产品索引 5872
      中文名称: PCR产物及凝胶回收试剂盒
      英文名称: MagExtractor?-PCR & Gel Clean up-
      产品编号: NPK - 600

      产品类别:

      分子生物学
      生产厂家: TOYOBO
      产品价格: 300元
      产品规格: 50次
      DNA Fragment Purification Kit
      MagExtractor?
      -PCR & Gel Clean up-
      使用说明书
      (Code No. : NPK – 601)
      TOYOBO CO. , LTD.Biochemical Operation Department
      OSAKAJAPAN
      —目录—
      [1] 前言 ........................................................................................... 1
      [2] 纯化流程 ...................................................................................... 2
      [3] 试剂盒中所包含的物品 ................................................................. 3
      [4] 试剂盒以外所需要的其他物品 ...................................................... 3
      [5] 回收DNA溶液 ............................................................................. 4
      [6] 回收琼脂糖凝胶 ........................................................................... 5
      [7] 疑难解答 ...................................................................................... 8
      注意:
      本试剂盒中所包含的都是研究用试剂。请不要用于诊断,临床等场合。在使用本试剂盒的时候,请严格遵守实验室的基本注意事项,注意安全。由于本试剂盒内含有对人体有害的试剂,所以请务必严格遵守各试剂的相关使用说明书,按要求使用保护罩等防护措施。

      [1] 前言
      MagExtractor - PCR & Gel Clean up-利用在Chaotropic(盐)试剂存在的情况下,核酸能吸附在硅胶上的特性 1 ,用于手动对DNA片段进行纯化。本试剂盒采用磁硅胶粒子,若使用磁性台架,则能最大限度地减少复杂的离心操作,能够快速地的纯化DNA片段。
      1)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(2) 615-619(1979)
      特征
      ·从DNA溶液(约100μl),以及TAE·TBE琼脂糖凝胶(约0.3g)中,
      能够以平均回收率60~70%比例回收DNA片段(约100bp~50kbp)。
      ·能够在5分钟之内从DNA溶液中,或者在15分钟之内从琼脂糖凝胶
      中回收DNA片段。
      ·由于在室温下琼脂糖凝胶可以被融解,因此无需进行加热反应。
      * 要彻底去除混杂在回收液中的乙醇时则需要进行加热处理(55℃)。
      试剂盒的用途
      ·脱盐,去除dNTPs。
      ·去除引物。
      ·去除酶(碱性磷酸酶等)。
      ·从电泳后的琼脂糖凝胶块中回收DNA。
      回收的 DNA 的用途
      ·RI.Non-RI测序反应
      ·限制酶反应
      ·标记反应
      ·杂交反应
      ·连接反应
      ·转化反应
      ·扩增反应
      [2] 纯化流程
      下图显示为使用MagExtractor-PCR &
      Gel Clean up-时的纯化流程。

      纯化 DNA 片段
      Elute
      75 %乙醇
      洗净液
      溶出液
      磁石
      磁性或离心分离
      磁珠
      Wash
      Bind
      Melt
      凝胶块
      吸附液
      电泳后的凝胶

      [3] 试剂盒中所包含的物品
      本试剂盒中包含以下试剂。(200次份)
      试剂量
      保存条件
      吸附液*
      88ml
      避光室温保存
      洗净液*
      132ml
      室温保存
      磁珠
      7ml
      室温保存
      *吸附液,洗净液在低温情况下会析出结晶。请一边用手捂暖,一边
      将其倒转混合让结晶溶解后使用。另外,吸附液及洗净液内含有蛋白
      变性剂。在使用时务必注意,万一沾到身体,请立刻用清水冲洗。
      [4] 试剂盒以外所需要的其他物品
      1 .试剂
      ·灭菌蒸馏水<溶出液>
      ·75%乙醇<洗净用>
      2 .器具,器材
      ·1.5ml小型试管用磁性台架
      ·简易台式离心机
      ·漩涡混合器
      ·Heat Block 55℃(用于在需要去除混于回收液中的乙醇的场合)
      *可使用本公司的磁性台架Magical Trapper(Code No.:MGS-101)等产品。
      [5] 回收DNA溶液

      1.前言
      ·本操作程序用于从DNA溶液(约100μl)中回收DNA片段。
      ·能够回收的DNA大小约为100bp~50kb。另外,40bp以下的核酸
      几乎能够被加以除去。
      · 磁珠的最大吸附量为每30μl磁珠大约吸附5μg。使用时请以2.5μg左右为参考量。
      ·能够从PCR反应液,限制酶反应溶液,碱性磷酸酶反应液等各种反
      应液中回收DNA。
      ·回收后的DNA,能够用于限制酶处理、测序、连接、标记、杂交等多种反应
      2 .操作程序
      DNA溶液(100μl) 1
      ↓← 400μl吸附液
      ↓← 30μl磁珠 2)
      ↓不时用漩涡混合器搅拌,并放置约1~2min(室温)
      B/F(固/液)分离 3
      ↓←(600μl洗净液) 4
      ↓漩涡混合器搅拌10sec,
      B/F分离。 3
      ↓←1ml75%乙醇 4
      ↓漩涡混合器搅拌10sec,
      B/F分离。 3
      瞬时高速离心,彻底去除上清部分。
      (打开小型试管的盖子,55℃下放置5min,干燥) 4
      ↓←25~100μl蒸馏水
      ↓漩涡混合器搅拌10sec,
      (在无法充分将粒子分离的情况下,请用pipetting来分离粒子。)
      ↓放置2min
      B/F分离,回收上清液。 5
      1)请尽量不要含矿物油。
      2)使用磁珠前,请彻底悬浊混合后再使用。
      3)将试管放置在磁性台架上,把磁珠挪近磁石,用微量移液器持续去除
      上清部分。通过乙醇清洗时,可以通过将上清液倒入其他容器进行去除。
      B/F分离时推荐使用对应于微型试管的磁性台架,但也可用简易台式离心机,用大约6,000r.p.m程度,5sec.的离心进行分离。g会根据离心机的转子口径而发生变化,所以请调整旋转数,使得能更有效地集合粒子,并保证凝结不至于过度。
      4)请参照3.的表。
      5)回收液中少量混入的磁珠并不会有碍下一次的反应,但在测定吸附度
      等场合时,请通过瞬时高速离心除去磁珠。
      3 .关于工序的省略,纯化规模
      · 洗净工序,加热工序可以省略(请参照下表)
      用途
      洗净
      干燥
      备注
      洗净液
      75 %乙醇溶液
      测序,限制酶反应,连接反应等的前处理
      1
      标准操作程序。回收的核酸能用于 Low Buffer 系列的限制酶切断。
      盐的混入会产生影响的场合
      2
      吸附液和洗净液含有高浓度的盐分。
      乙醇的混入会产生影响的场合
      1 次( 2 次)
      55 ℃, 5min
      用于易受乙醇影响的前处理。
      要去除混入的酶的场合
      1
      1 次( 2 次)
      用于去除碱性磷酸酶等。
      要通过吸光度来准确定量核酸浓度的场合
      1
      2
      吸附液内含有能吸收紫外线的物质。
      ·根据DNA溶液的量,可以按比例减少本试剂盒中附带的吸附液、洗净
      液和磁珠的使用量。此时,无需减少75%乙醇溶液的使用量。
      [6] 回收琼脂糖凝胶
      1 .前言
      ·本操作程序适用于从TAE或者TBE琼脂糖凝胶(约0.3g)中回收
      DNA片段。本操作程序是以琼脂糖浓度2%以下的凝胶为对象。
      要使用2%以上的凝胶时,推荐所使用凝胶的量少于0.3g。另外,本
      操作程序不需要使用特殊的低融点琼脂糖凝胶。
      ·能够回收的DNA大小约为100bp~50kbp。
      ·回收后的DNA主要用于连接反应、标记、测序等反应。
      2 .操作程序
      琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色。
      在UV照射下(Long wave),为了使得目标条带尽可能地变小,使
      用切割刀或手术刀等进行切开。
      把切开的琼脂糖切细,放到1.5ml小型试管中。(此时称得重量,如
      果大于0.3g则分几次进行。) 1
      ↓←400μl吸附液
      在凝胶完全溶解之前,将其放置在室温中,并不时进行搅拌。 2
      ↓←30μl磁珠 3
      ↓经常用漩涡混合器搅拌,并放置2min(室温),
      B/F分离。 4
      ↓←600μl洗净液
      ↓漩涡混合器搅拌10sec,
      B/F分离。 4
      ↓←1ml75%乙醇溶液 5
      ↓漩涡混合器搅拌10sec,
      B/F分离。 4
      瞬时高速离心,彻底去除上清部分。
      (打开微型试管的盖子,55℃下放置5min,干燥) 5

      ↓←25~100μl蒸馏水
      ↓漩涡混合器搅拌10sec
      (在无法充分分开粒子的情况下,请用pipetting来分散粒子。)
      ↓放置2min
      B/F分离,回收上清液 6
      1)将琼脂糖凝胶制成切片,以利于溶解。
      2)如果想要快速溶解琼脂糖凝胶或凝胶难以溶解时,请加温至55℃
      5min。
      3)使用磁珠前,请彻底混合后再使用。
      4) 将试管放置在磁性台架上,把磁珠挪近磁石,用微量移液器持续去
      除上清部分。要洗净乙醇,也可以通过将上清液倒入其他容器来去除。
      B/F分离时推荐使用对应于微型试管的磁性台架,但也可使用简易台式离心机,用大约6,000r.p.m程度,5sec.的离心进行分离。g会根据离心机的转子口径而发生变化,故请调整旋转数,使得更有效地集合粒子,并保证凝结不至于过度。
      5) 请参照3.的表。
      6) 回收液中混入少量磁珠并不会有碍下一次的反应,但在测定吸附
      度等场合时,请通过瞬时高速离心除去磁珠。
      3 .关于工序的省略,纯化规模
      ·洗净工序,加热工序可以省略(请参照下表)
      用途
      洗净
      干燥
      备注
      洗净液 *
      75 %乙醇溶液
      连接反应 , 测序等
      1
      1
      标准操作程序。
      盐的混入会产生影响的场合
      1
      2
      吸附液和洗净液中含有高浓度的盐分。
      乙醇的混入会产生影响的场合
      1
      1 次( 2 次)
      55 ℃, 5min
      用于容易受乙醇影响的前处理。
      要通过吸光度来准确定量核酸浓度的场合
      1
      2
      吸附液内含有吸收紫外线的物质。
      *从琼脂糖凝胶中回收核酸时,必须用洗净液清洗。

      ·根据DNA溶液的量,可以按比例减少本试剂盒中附带的吸附液、洗净
      液和磁珠的使用量。此时,无需减少75%乙醇溶液的使用量。
      [7] 疑难解答
      1 .回收量低
      原因
      对策
      去除乙醇不彻底
      瞬时高速离心后,请仔细去除 75 %乙醇溶液。
      溶出不充分
      通过 10mM Tris-HCI pH8.0 ),或者 TE buffer 能够提高溶出的效率。另外,如果加温至 55 ℃保持 2min 能够更加有效地提高溶出效率。
      吸附时间不合适
      如果吸附过剩,回收量则会变少。最恰当的吸附时间是,对于 DNA 溶液为 1 2min ,对于凝胶则为 2min
      溶出时的搅拌不充分
      溶出时,如果磁珠的混合不充分,回收量会减少。在瞬时高速离心后,磁珠会在底部结块,请仔细将其散开。特别是在从琼脂糖凝胶中进行纯化的时候,结块的磁珠会比较难以重新散开。
      琼脂糖凝胶的量大于 0.3g
      请减少琼脂糖凝胶的量。
      使用 2 %以上的琼脂糖
      请减少琼脂糖凝胶的量。
      没有用洗净液清洗
      从琼脂糖凝胶中回收 DNA 时,请务必先用洗净液清洗。
      2 .回收的核酸的吸光度不准确
      原因
      对策
      清洗不充分
      吸附液中含有吸收紫外线的物质。要对回收的核酸定量,请用洗净液以及 75 %乙醇溶液来清洗。
      混入了吸附液
      吸附液中含有吸收紫外线的物质。请仔细去除吸附液。用面纸等擦拭试管的盖子上沾有的吸附液,可以有效改善状况。

      3 .回收后的核酸不能良好地进行反应
      原因
      对策
      盐阻碍了反应
      请添加两次 75 %乙醇溶液进行清洗的工序。吸附液和洗净液都含有高浓度的盐分。
      乙醇阻碍了反应
      请按照操作程序,对乙醇进行干燥处理。
      酶未能完全去除
      要去除反应液中的碱性磷酸酶等酶,请用洗净液以及 75 %乙醇溶液进行清洗。
      反应用的酵素过少
      从琼脂糖凝胶中回收核酸时,反应用的酶量应比通常要多,这样就能得到准确良好的结果。
      使用的琼脂糖级别不够
      请使用高级别的琼脂糖。
      从琼脂糖凝胶中分离条带时,受到的紫外线照射过多
      请用 Long wave 365nm 附近)的紫外线来进行切片工作。
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