植物基因组DNA提取试剂盒-MagExtractor?-Plant Genome-

Nucleic Acid Purification Kit

MagExtractor

-Plant Genome-

使用说明书
（Code No.：NPK- 500）
TOYOBO CO., LTD. Biochemical Operations Department
OSAKAJAPAN

—目录—
目录 页数
1．前言.......................................................................................................................... 1
2．使用前须知.............................................................................................................. 1
3．试剂盒中所包含的物品.......................................................................................... 2
4．操作程序.................................................................................................................. 2
1］试剂盒以外所需要的其他物品...................................................................... 2
（1）试剂............................................................................................................. 2
（2）器具及器材................................................................................................. 3
2］抽提流程.......................................................................................................... 3
3］样品前处理...................................................................................................... 4
4］使用MFX-2000进行Plant DNA抽提......................................................... 4
（1）操作程序的选择......................................................................................... 4
（2）加温block以及回收block温度的设定.................................................. 4
（3）附带专用过滤器的tip安装....................................................................... 5
（4）专用试管的安装......................................................................................... 5
（5）试剂的安装................................................................................................. 6
（6）样品的安装................................................................................................. 8
（7）抽提开始..................................................................................................... 8
（8）样品的回收................................................................................................. 8
5］使用手工方法进行Plant DNA抽提............................................................. 8
5．一般样品的分析...................................................................................................... 9
1］DNA定量测定................................................................................................ 9
2］电泳............................................................................................................... 10
3］PCR............................................................................................................... 10
6．抽提实例................................................................................................................ 10
7．疑难解答................................................................................................................ 11

注意事项

本试剂盒中所包含的所有试剂属研究用试剂。请不要用于诊断或临床等场合。在使用本试剂盒的时候，请严格遵守常用的实验室安全操作程序。
Hoffman-La Roche Ltd.拥有PCR方法的专利权。

1．前言
MagExtractor-Plant Genome-利用在Chaotrpic（盐）的情况下，DNA吸附于硅胶表面的特性，进行plant DNA的抽提。本试剂盒与自动核酸抽提装置MFX-2000并用，可简便地从植物叶及植物培养细胞等植物样品中抽提出高纯度的plant DNA。另外，本试剂盒也可用作手动抽提用试剂盒而加以使用。

特征
·本试剂盒用于从植物标本如培养细胞和叶子以及其它植物组织中进行DNA抽提。
·无需进行乙醇沉淀，可以实现快速抽提。
·不使用苯酚。
·不使用RNase。
·所抽提的DNA被回收到TE缓冲液中，可以被直接用于PCR或者其它分析方法。

2．使用前须知
·MagExtractor-Plant Genome-适用于以下样品：

对应样品	样品量	主要用途
植物标本，如叶子以及培养细胞	0.01 到 0.1g	PCR

参见第十页“6. 抽提实例”。

·有关溶解液的储存
由于本试剂盒是在低温下进行储存以及运输，因此溶剂中的表面活性剂成分将有所沉淀。按照以下的步骤，请在室温（20~30℃）下进行相应的溶解以及储存。从溶剂的表面上看，有些情况下可能没有任何沉淀出现，但是，可能已形成了透明凝块，故在使用之前，务必进行以下操作。同样，如果在储存期间产生沉淀，也进行相同的操作并进行溶解。其它试剂请在4℃下进行储存。
（参照第2页“[3] 试剂盒中包含的物品”。）

（1）在50℃的水浴下，加热10分钟。
（2）轻轻地上下转动瓶子以溶解沉淀的凝块。（剧烈摇动会形成泡沫。）
（3）在50℃的水浴下中，再次加热5分钟。
（4）轻轻地上下转动瓶子以进行完全溶解。
如果在溶液中仍然有一些未溶解的部分，则在水浴下中再次加热5分钟并上下转动混合直到未溶解的部分完全被溶解。
（可能会形成透明凝块，请进行两次检查以确保完全溶解。）

·建议在室温（20~30℃）下使用本试剂盒。低温会导致溶剂成分的沉淀可能会影响
本试剂盒的性能。

3．试剂盒中所包含的物品
在本试剂盒中含有可以抽提出100份RNA样品的试剂。请在以下的温度下储存这些试剂：

试剂	容量	储存
溶解液	40ml	溶解后，在室温（ 20~30 ℃）下保存。
吸附液	90ml	4 ℃
洗净液	200ml	4 ℃
磁珠	5ml	4 ℃

·分别以各自规定的温度进行保存，并且在使用之前请先将它们回复到室温状态。另外，也可以在室温（ 25 ℃以下）下进行（ 1 个月内）短期储存。

·吸附液以及洗净液含有高浓度的蛋白质变性剂。在处理时应小心谨慎并戴上手套以及其它防护用具并且实施适当的安全预防措施。万一试剂沾在手或者皮肤上，请用清水充分清洗。如若碰到眼睛，请立刻用清水清洗，然后去看医生。

·如果使用本公司的 MFX-2000 自动核酸抽提装置，请将所需的量倒入指定的试管中，并将其安装在规定的位置上。

（参照第 6 页“ 4 - [4] - （ 5 ）试剂的安装”。）

4．操作程序
1］试剂盒需要的其他物品
（1）试剂
·液氮
·氯仿/异戊醇
将氯仿：异戊醇*1以比例24：1（体积比）混合
·灭菌水
市场上销售的纯水或者经过高温高压蒸汽灭菌消毒处理过的milli Q水。
·乙醇
99.5％以上的特级品。用于手动抽提时，请使用70％的乙醇。
·TE缓冲液（pH 8.0）
10mM Tris-HCI（pH 8.0），lmM EDTA（pH 8.0）

*1又被称为3-甲基-1-丁醇。

（2）器具及器材
·微量移液器
·微量移液器用tip
·（具有大约3,000到12,000 rpm的）台式离心机
·加温block（也可以是水浴槽，65℃）
·1.5ml微型试管

当使用MFX-2000时：
·抽提专用试管（Code No.：MFX-301）.......................................... 用于样品回收
·抽提专用6连试管（Code No.：MFX-302）................................... 用于进行抽提
·附带专用过滤器的tip（Code No.：MFX-402）
·安装试剂用试管（50ml、15ml、2ml）*1

2］抽提流程
经简单的前处理之后，MagExtractor -Plant Genome-可以使用MFX-2000进行自动抽提。以下是关于抽提流程的说明。

←溶解液 ........................................................................................................ ［细胞分解］

←在 65 ℃下进行 10 分钟

←氯仿抽提 .............................................................................................. ［多聚糖的去除］

←吸附液 前处理约 15 分钟

←磁珠：大约 2 分钟 ................................................................................... ［ DNA 的吸附］

B/F 分离

←洗净液：大约 5 秒（ 2 次） .......................................................... ［非特异吸附物的去除］

B/F 分离

← 70 ％的乙醇：大约 5 秒（ 2 次） .................................................. ［蛋白质变性剂的去除］

B/F 分离

←抽提液（ TE ）：大约 2 分钟 ...................................................................... ［ DNA 的溶出］

B/F 分离

上清液的回收（ 100 μ l ） 自动抽提总共耗时大约 10 到 12 分钟

即使用当手工方法进行抽提，在前处理之后， DNA 抽提也只需耗时约十五分钟。（参照第八页上的“［ 4 ］ - 5 使用手工方法进行 Plant DNA 抽提”。）

3］样品前处理
进行DNA抽提时使用MagExtractor-Plant Genome-试剂盒进行DNA抽提时要求对所使用的样品进行前处理。（参照第三页上的“[4] –[2]抽提流程”。）
根据以下步骤，进行前处理。

（1）将储存在液氮中的0.01~0.1g的样品磨碎。（快速进行该项，并同时补充液氮以避免样品融解。）
（2）将样品移入1.5ml试管中。（使用液氮或者其它方法对使用的药匙及试管进行提前冷却以避免已磨碎的样品被融解。）
（3）在样品中添加300μl的溶解液并进行充分混合。（确认其没有沉淀后再进行添加。如果有沉淀，请参照第一页“2. 使用前须知”并对沉淀进行溶解。）
（4）使用旋涡混合器，剧烈振动10秒钟。（只有将样品完全浸没溶剂之后，才能进行振动。）
（5）在65℃下培育10分钟。（使用旋涡混合器，每隔3到4分钟进行共2次的剧烈搅拌，每次5秒钟。）
（6）添加300μl的氯仿/异戊醇。
（7）剧烈混合3~5秒钟。（旋涡混合器可能无法使溶液被完全均匀地混合，可用手剧烈摇动使其混合。）
（8）用离心机以12,000 rpm的速度进行1分钟的离心。（根据样品的不同情况，可能会有少量的沉淀。如果发生了这种情况，请再用离心机进行2~3分钟的离心。）
（9）将250μl的上清液回收到一个未使用过的1.5ml试管中。（如果上清液少于250μl，则必须非常仔细地进行操作，同时对溶液界面进行抽吸以回收上清液。上清液的量因样品而有所不同。
例： 0.1g的烟草大约有250μl
0.1g的水稻植物大约有200μl
（10）添加600μl的吸附液。
（如果上清液少于100μl，则添加750μl吸附液。）

4］使用MFX-2000进行Plant DNA抽提
在使用MFX-2000之前，请务必通读完其使用说明书。
（1）操作程序的选择
现在可供使用的MFX-2000程序可针对DNA、Total RNA、质粒DNA等的抽提。使用MagExtractor-Plant Genome-请用第13号操作程序。

（2）加温block以及回收block温度的设定
将加温block以及冷却 block设定成如下所述的温度：
加温block 冷却 block
温度设定 OFF 10℃

·由于不使用加温 block，请切断其电源。
·使用简易保冷block时，请将block事先置于冷藏库或是低温室进行予冷。简易保冷可用于回收液的临时保冷。

（3）附带专用过滤器的tip安装
将具有专用过滤器的tip安装在tip架上。相关数量，请参见以下表格。
·请务必使用附带专用过滤器的tip（Code No.：MFX-402）。
·tip已经过γ射线消毒。在进行安装时，一定要使用手套。
·安装超过规定数量的tip不会引起任何问题。
·将必要量的tip从左下方开始，垂直地排列在tip架上。有关安装位置的更多细节，请参见MFX-2000使用说明书。

样品数	tip 数	样品数	tip 数
1	6	13	39
2	8	14	41
3	10	15	43
4	12	16	45
5	17	17	50
6	19	18	52
7	21	19	54
8	23	20	56
9	28	21	61
10	30	22	63
11	32	23	65
12	34	24	67

（4）专用试管的安装
根据样品个数，将专用试管（编号.：MFX-301）或者特制的6连试管（编号：MFX-302）安装在抽提架的A到F的插槽以及回收block上。
·除了以上提及的专用试管，不得将其它试管安装在抽提架中，否则容易产生故障。
·专用试管（编号：MFX-301）以及带螺旋帽的1.5ml试管*1被设置在回收block中。
·有关设置位置的更多细节，请参照MFX-2100使用说明书。

*Assist试管（编号：72.692）等

（5）试剂的安装
将试剂注入到规定的试管中并将它们安装在指定的试剂架上。
·确认每种试剂是否都已回复到室温。
·试剂的必需量依据样品的数量而定。请参照下页的表格，安装试剂。
·在进行分装之前，请充分地搅动磁珠并进行确认，直到这些磁珠已均匀混合。然后将它们分装到2ml试管中。另外，在注入磁珠后，请立刻（10分钟之内）启动仪器，否则会导致产物有很大的差异并有可能导致仪器发生故障。
·使用微量移液器分装磁珠。对于其它试剂，则将试管上的刻度标记作为分装时的标准。
·抽提后所剩的试剂可以被再次使用。但是，如果长时间存放不用，则由于蒸发或者其它现象液体成分可能会发生变化。请务必注意。
·请注意本试剂盒并不包含灭菌水、乙醇（99.5％以上的特级品）以及TE缓冲液（pH8.0）。（参照第2页上的“4 - [1] - (1)试剂”。）

安装位置	试剂名	试管容量
1	灭菌水	50ml
2	洗净液	50ml
5	乙醇	50ml
7	磁珠	2ml
9	TE 缓冲液（ pH8.0 ）	15ml

每种试剂的使用剂量

试剂	灭菌水	洗净液	乙醇	磁珠	TE
试管容量	50ml	50ml	50ml	2ml	15ml
安装位置	1	2	5	7	9

各试管中分装的试剂量（ ml ）

样品数	1	5 (20)	5 (20)	5 (20)	0.5 (1.5)	2 (5)
	2
	3		10 (20)	10 (20)
	4
	5		15 (20)		0.8 (1.5)
	6	10 (20)		15 (20)		3 (5)
	7
	8		20 (20)
	9
	10			20 (20)
	11		25 (35)
	12
	13				1 (1.5)
	14		30 (35)	25 (35)
	15
	16	15 (20)	35 (35)			4 (5)
	17
	18			30 (35)	1.3 (1.5)
	19		40 (45)
	20
	21
	22		45 (45)	35 (45)
	23				1.5 (1.5)
	24

·上表中所示根据样品总数而定的每种试剂分装量的参考标准。这些数值都含有保留量，因此，请根据这些数值将试剂分装到试管中。

·圆括号中的数值代表当试剂分装到试管中时的最大容许量标准。分装量超过这些数值可能会造成喷嘴污染、引起溢出等其它问题。

（6）样品的安装
按照第4页上的“4 – [3] 样品前处理”来制备样品，并把它们安装在抽提架上。
·如果使用带有螺旋帽的1.5ml样品试管，则剪掉盖子连结部后将它们放在样品的安装位置上。
·将它们按照顺序安装在编号1～24的插孔中。

（7）抽提开始
按照以下标准，开始进行抽提。
①确认是否按照所规定的说明安装了样品、试管、专用试管（抽提架以及回收block）以及专用tip。
②确认每个架子的安装位置以及工作台是否已完全收纳到里面（直至听到“咔喳”声）。关上机器前门。（如果机器前门未完全关上，则抽提不会开始。）
③接通MFX-2000的电源。
④在液晶显示屏上将出现“操作程序”以及“样品数”。输入操作程序“13”并且在“样品数”中输入样品数量的数值。
⑤屏幕上会显示提示“请按下启动键”，后按下“START”。
⑥抽提启动后液晶显示屏上会显示“操作中”。

（8）样品的回收
在完成抽提后，打开机器前门并取出样品。
·在完成抽提后，所抽提的DNA将回收到安装在回收block上的试管中。在液晶显示屏上也将再次出现“请按下启动键”。
·在已经证实了仪器已完全停止运转之后，从回收block中取出试管并在冷藏或者在低温（4~10℃）下储存直到再次使用这些试管。
·从磁珠中溶出的DNA，由于使用的是大约100μl的溶出液（TE缓冲液），因此回收液也为100μl左右。

5］使用手动法进行Plant DNA抽提
本试剂盒也可以用于手工DNA抽提。可按照以下步骤进行抽提。
·对于磁珠分离，建议使用市场上销售的1.5ml微型试管用磁性台架。另外，使用台式离心机以3,000 rpm 程度离心15秒钟也能够进行分离。
·未包含在本试剂盒中的其它必需物品
请参照第2页“4 – [1] – (1)试剂”。
请事先制备将特级乙醇与灭菌水按7：3比例混合的70％乙醇溶液。（每个样品需要大约2ml。）

①取出按照第4页“4 – [3] 样品前处理”制备的样品。
②添加40μl磁珠。（在使用之前请将磁珠进行充分的混合。）
③使用试管混合器来进行1分钟的剧烈混合。［DNA的吸收］
④将试管安装在磁性台架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。（此时，对这些磁珠进行数次颠倒混合并且尽可能多地回收粘在盖子上的磁珠。）
⑤去除上清液。
⑥添加900μl洗净液。
⑦使用旋涡混合器剧烈混合5秒钟。（此时，确认磁珠是否已被充分地分散以及混合。）
⑧将试管安装在磁性台架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。（此时，对这些磁珠进行数次颠倒混合并且尽可能多地回收粘在盖子上的磁珠。）
⑨去除上层清液。
⑩重复步骤⑥~⑨。
⑾添加900μl的70％乙醇溶液。
⑿使用旋涡混合器剧烈混合5秒钟。（此时，确认磁珠是否已被充分地分散以及混合。）
⒀将试管安装在磁性台架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。（此时，对这些磁珠进行数次混合并且尽可能多地回收粘在盖子上的磁珠。）
⒁去除上清液。
⒂重复步骤⑾~⒁。（尽可能多地去除包括乙醇在内的任何残留在盖子上的物质。）
⒃添加100μl TE缓冲液。
⒄使用试管混合器剧烈混合1分钟。［DNA的溶出］
⒅将试管安装在磁性台架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。
⒆将含有DNA的上清液回收到一个未用过的1.5ml微型试管中。

5．一般样品的分析
请按照以下注意事项进行操作。
1］DNA定量
·当用吸收度检测法进行DNA定量测定时，请务必用离心机分离所回收的溶液（12,000 rpm， 1分钟）并使用上清液。
·当计算A260nm/A280nm比例以及DNA浓度时，请务必用A320nm数值进行校正。

DNA 浓度	(A260-A320) x 50 μ g/ml
A260nm/A280nm	(A260-A320) /(A280-A320)

2］电泳
·若将一部分回收液直接用于电泳，请将Loading Dye的量增加为通常的1.5到2倍，否则可能会发生样品无法沉入样品孔中，使得电泳失效。
3］PCR
·回收液中混有大约10％的乙醇溶液。如果直接用于PCR，可能会阻碍反应的进行。因此，不要超过反应总液的五分之一（即：在每50μl的反应液中最多可有10μl）。
·可能会在所回收的溶液中混入了少量的磁珠。但这并不会阻碍PCR。

6．抽提实例
以下是使用MFX-2000从0.1g样品中进行抽提的实例。

样品	回收量
烟草（叶子）	3~5 μ g
烟草（培养细胞）	2~3 μ g
水稻植物（叶子）	3~5 μ g
Arabidopsis thaliana （叶子）	1 μ g
番茄（叶子）	3 μ g
卷心菜（叶子）	3 μ g
玉米（叶子）	3~4 μ g

·回收量根据不同的样品类型以及条件而会有所变动。请以本书中所述的数值作为标准。

原因	对策
样品过剩	即使使用规定量以上的样品，也不会使回收量上升，反而会使效率下降。请减少样品量。另外，有的样品单位重量下体积可能会很大。如果无法浸没在溶解液中，则也请减少样品量。
破碎不充分	液氮下的冻结粉碎不充分是一个原因。进行充分的破碎处理直到它成为细粉末。并请注意破碎时不要使样品解冻。
溶解不充分 （ 1 ）氯仿抽提液为 250 μ l 左右的情况 （ 2 ）氯仿抽提液低于 150 μ l 或者非常少的情况	可能是溶解液与样品之间混合不充分，或者样品本身难以溶解所致。将溶解液与样品进行充分混合，使用旋涡混合器振动 1 分钟后再进行抽提。（通常为 10 秒钟） 可能是样品内水份含量较少而吸收了部分溶解液。请添加溶解液至 350~400 μ l 并按照以上（ 1 ）的对策继续进行抽提，即可获得良好效果。
试剂量不足 （ MFX 抽提）	确认试剂量是否不足或者检查残留物的数量。如果几乎没有任何残留物（ 200 μ l 以下），说明试剂量不足。
吸附，溶出不充分 （手动抽提）	使用手动法时，通过使用试管混合器搅动 1 分钟来使磁珠吸收 DNA 以及从磁珠中分离出 DNA 。（参照第 9 页 “ 5 - [5] 手动抽提法” ( 3 ) ， ( 17 ) ）。各搅拌 10 分钟左右，则 DNA 回收量将会增加。

·回收量可能视样品的类型以及储存条件而有所不同。