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RT-qPCR实验具体操作过程

放大字体缩小字体发布日期:2024-04-25 来源:上海抚生实业有限公司
核心提示: qPCR: Quantitative Real-time PCR,中文名是 实时荧光定量PCR。qPCR是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链
qPCR: Quantitative Real-time PCR,中文名是 实时荧光定量PCR。qPCR是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

RT-qPCR 是一种用于实时扩增和检测特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物学技术。该方法利用荧光染料或探针,当与扩增的 DNA 或 RNA 分子结合时会发出信号,从而可以对目标序列进行量化。RT-qPCR 通常用于基因表达分析、病毒载量定量和基因突变检测等应用。

RT-qPCR原理的三个主要步骤:

1 反转录:

· 使用逆转录酶和特定引物将RNA样品反转录成cDNA。

· 该步骤将RNA模板转化为更稳定且可扩增的DNA形式。

· 反转录过程中使用特定引物。

2 PCR扩增:

· 使用特定引物对cDNA进行PCR扩增,这些引物环绕目标区域。

· PCR是一个循环过程,呈指数级扩增DNA模板的数量。

· PCR反应中包含荧光染料或探针,它们结合到扩增的DNA序列上并发出荧光信号。

3 荧光实时检测:

· 使用实时PCR仪器实时监测荧光信号。

· 荧光的数量与每个PCR循环中扩增的DNA数量成比例。

· 使用专业软件分析数据以确定循环阈值(Ct)值,该值表示荧光信号达到特定阈值水平所需的循环数。Ct值用于计算原始样品中存在的目标DNA量,从而允许进行基因表达或病毒载量等定量分析。

实验步骤:

一、RNA提取:

RNA的提取是参照全式金生物的Transzol up提取试剂盒完成的。

1、离心机4℃预冷,准备试剂:氯仿、异内醇、75%乙醇(用DEPC水配制)、无RNase的水或DEPC水、无酶吸头及试管,戴口罩、帽子、无粉乳胶手套;

2、取出转染建模成功24h后的细胞,吸弃培养液,用1×PBS清洗1次;

3、每10cm2生长的细胞加入1mL的Transzol Up, 放置片刻后使用移液枪吹打细胞使其全脱落;

4、用移液枪反复吹吸裂解液直至无明显沉淀,将裂解液全部转移至标记好的1.5mL EP管中,室温静置5min;

5、往每个EP管中加0.2mL氯仿(Transzol Up体积的1/5),混匀振荡30s,室温静置3min;

6、4℃条件下10000g离心15min,离心后RNA主要分布在上层水相中,体积约50%;

7、转移上层水相于新的EP管中(约400μL,注意不要吸取到下层),每管加入0.5mL异丙醇 (Transzol Up体积的1/2),颠倒混匀,室温孵育10min;

8、4℃下10000g离心10min后在管侧和管底形成胶状沉淀,吸弃上清,加1mL 75%乙醇吹悬沉淀;

9、4℃下7500g离心5min后弃上清,尽量吸净,室温晾干沉淀5min,依细胞量加入30~100μL的RNA溶解液;

10、55℃~60℃金属浴10min,-80℃冰箱保存备用。

二、cDNA合成

三、qPCR:

在ABI荧光定量PCR仪专用96孔板中建立qPCR反应体系,反应程序为两步法。

4、RT-qPCR统计:每个基因在不同组别中的表达在获得3个重复的Ct值后,从ABI系统中拷贝原始数据,挑出“Ct SD”值大于0.5的组别(需重新实验),求出各个组的管家基因GAPDH的均值(一般相差1个Ct值以内),再依次求出实验组和对照组与各自的GAPDH之间的Ct差值,即得到第一个ΔCt,随后求出实验组ΔCt和对照组ΔCt的差值,即可得到第二个ΔCt(ΔΔCt),最后使用2-ΔΔCt法求出实验组相对于对照组的Ct值变化倍数(实验组2-ΔΔCt/对照组2-ΔΔCt=实验组2-ΔΔCt/2 0=实验组2-ΔΔCt)。将3组实验组数据导入Graphpad 9.0,输入对照组数据为1,使用Student's t或ANOVA进行假设检验,p<0.05被认为有统计学差异。

编辑:songjiajie2010

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