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1.1复色光对比耳定律的偏离
比耳定律成立的前提条件是入射光是单色光，但是精度再高的仪器，即使是双单色器的分光光度计，也只能获得近乎单色的光，无法获得纯单色光，它仍然含有狭窄光通带，具有复色光的性质。而复色光会导致比耳定律的正或负偏离。
固定狭缝的紫外分光光度计光谱带宽一般为1nm或2nm，可调狭缝的可以做到0.Inm；可见分光光度计带宽6nm、snm，甚至十几纳米。
光谱带宽应该是越小越好，但是随着光谱分辨率的提高，仪器的灵敏度降低，所以选择仪器时要综合考虑各种条件的影响。当溶液浓度较小且单色光较纯时，可近似认为符合比耳定律。
1.2杂散光的影响
杂散光是指进人检测器的处于待测波长光谱带宽范围外的其他波长组分，它是光谱测量中误差的主要来源。
产生原因有:分光光度计的色散元件、反射镜、透镜及单色器内壁灰尘等。在分光光度计工作波段边缘波长处，由于单色器透光率、光源辐射强度、检测器灵敏度都较低，杂散光的影响更为显著。
杂散光限制仪器的分析上限可引起严重的测量误差，实际工作中，在定量分析时，一般在吸收峰或其附近处测量样品吸光度，如果在分析波长处含有杂散光，这时样品的透光率较小，而杂散光大部分透过，使测量吸光度低于真实吸光度。
1.3仪器噪声对测t的影响
仪器噪声也是仪器的一个重要指标，它表征仪器做稀溶液的能力。是叠加在待测量的分析信号中的不需要的信号，扫描100%T和0%T线，可观察到分光光度计的绝对噪声水平，如果仪器噪声较大，会掩盖较小的测量信号，一般用噪音的二倍来表示仪器的灵敏度。
1.4波长和吸光度准确度
样品的每一个值都是在一定的波长下测得的，如果波长误差很大，测出的值肯定不准。吸光度准确度也是用户对仪器的直接要求，更应引起足够的重视。
国家计量检定规程规定双光束紫外可见分光光度计透射比准确度为A级士0.6%， B级土1.0%。
2测量条件的选择
2.1参比溶液和溶剂的选择
分光光度计的测量实际上是以通过参比池的光强度作为人射光强度来测定试样的吸光度，先调节仪器使透过参比池溶液的吸光度为零，然后让同一束光通过样品，使得吸光度比较真实地反映待测物质的浓度，所以参比溶液的选择非常重要。
如果仅有待测物质与显色剂的反应产物有吸收，可用纯溶剂或蒸馏水作参比溶液。如果显色剂有颜色，并在测定波长下有吸收，则用显色剂溶液作参比溶液，所加人显色剂及其它试剂的量，与试样中的加入量应一致。
如果样品中其它组分本身的颜色对测定有干扰，而所用显色剂没颜色，则用不加显色剂的样品溶液作参比液。
正确选择合适的溶剂，对提高分析的准确度起重要作用。为减小溶剂中杂质的影响，应选择高纯度的溶剂；溶剂应不与待测物质发生化学反应；待测物在溶剂中要有一定的溶解度；在测定的波长范围内，溶剂本身没有吸收，注意常用溶剂的最短可用波长；当用挥发性大的溶剂时，测量过程中吸收池应加盖。
2.2测试波长的选择
当用分光光度计对溶液进行测定时，首先需要选择合适的测量波长。选择的依据是该被测溶液的吸收曲线。在一般情况下，我们总是选择最大吸收波长作为测量波长，这样可以提高灵敏度。
而在有些情况下最大吸收峰很尖锐、吸收过大或附近有干扰存在，就不能选最大吸收波长，而必须在保证有一定灵敏度的情况下，选择吸收曲线中的其它波长进行测定(曲线较平坦处对应的波长)，以消除干扰。绘制吸收曲线是正确选择波长的有效手段和方法。
3、分光光度计的检验小妙招
波长准确度的检验
分光光度计在使用过程中，由于机械振动、温度变化、灯丝变形、灯座松动或更换灯泡等原因，经常会出现刻度盘上的读数与实际通过溶液的波长不符合的现象，因而导致仪器灵明度降低，影响测定结果的精度，需要进行检验。
检验波长准确度最简单的方法是用干涉滤光片或镨钕滤光片测量仪器的吸收峰值, 如果测出的值与滤光片标准值之差超出规程规定, 则需要进行波长调节。
透射比正确度的检验
用透射比标准值分别为10 %、20 %、30 %左右的光谱中性滤光片，可见光区分别在440、546、635nm波长处，以空气为参比，分别测量各滤光片的透射比，紫外光区用重铬酸钾溶液分别在235、257、313、350nm波长处，以高氯酸溶液为参比，测量其透射比。
稳定度的检验
在零点不受光的条件下，用零点调节器将仪器调至零点，观察3分钟读取透射比的变化，即为零点稳定性。在仪器测量范围两端向中间靠10nm处，调节零点后，盖上样品室盖(打开光门)，使光电管受光，调节透射比为95%（数显仪器调至100%）察3分钟读取透射比的变化，为光电流稳定性。
光的检验
可见分光计棱镜式仪器在420nm处，光栅式仪器在360nm处，紫外分光计在220nm处分别用符合规定的截止滤光片，以空气为参比，测量其透射比值，即为仪器在相应波长下的杂散辐射率。
