异常峰分析

异常的色谱峰指的是色谱图中的无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。异常峰是色谱实验工作中最棘手的问题。这些峰严重影响色谱分析的结果。色谱图中不可能有纯正的高斯对称峰,轻微的拖尾是正常的,这是由分离系统所决定的。在此仅对几种异常峰进行分析。

1.峰前或峰后有小峰的分析

产生原因大致分为以下几种情形

(1)样品不纯。可改变不同的流动相和色谱柱,对样品进行分离比较,选择合适的分离条件。

(2)分析柱或保护柱柱头塌陷。此情况较常见,可更换分析柱或保护柱后对峰形进行比较。柱头塌陷时往往所有的峰都会出现峰分裂。对色谱柱再生和清洗可以改善分离效果。

(3)色谱柱柱容量下降。当长时间使用后,有一些强保留组分吸附在柱子中,不大的进样量往往就会出现峰分裂。用强洗脱能力的溶剂清洗色谱柱,或更换色谱柱可使问题得到改善。

(4)样品溶剂与流动相不匹配或进样体积过大。当样品溶剂比流动相极性大时,有时即使进样体积很小,也容易出现峰变形和裂分现象。建议用流动相溶解样品。

(5)流动相不恰当。此情况较罕见,有些样品在特定的色谱条件下可能存在结构的动态平衡,而出双峰,这种双峰是无法分离完全的,改变色谱条件尤其是p H值会使峰形正常。

(6)样品分解。不稳定的样品在色谱分离过程中变成其他物质而出现双峰。这时需改变样品处理方法或色谱分离条件。

2.负峰分析

在色谱分析中有时会出现负峰或倒峰,如图3中的大峰的左下就有一负峰。出现这种现象可能是由以下几种原因引起的,可针对不同情况进行排除,进而使问题得到解决。

(1)流动相吸收本底值过高。此时可适当改变检测波长。

(2)进样过程中进入空气。进行排气处理,直到基线平稳再进样。

(3)样品组分的吸收低于流动相。可改变流动相或改变检测波长。

(4)配制样品的溶液与流动相不一样。重新配制样品,用与流动相一样的溶剂配制或稀释样品。

3.前沿、拖尾峰分析

拖尾：1干扰峰，优化条件分离；2色谱柱塌陷，更换色谱柱；3流动相pH不合适，调节pH值；4管路没有接好，存在较大的死体积，可以重新接一下。

前沿：1溶剂选择不合适，选择合适的溶剂；2样品过载，降低进样量；3柱温太低，升高柱温；4色谱柱损坏，更换色谱柱；

图谱前沿和拖尾的原因主要是流动相选择不合适，可以相应调整流动相的极性，或者适当加入酸来调整，可以得到较好的改善。一般来讲，酸碱在流动相中对于前沿和拖尾影响较大。柱前沿是可能因为柱超载，拖尾是可能因为样品被污染，选择合适的流动相，调节好PH能够改善这以情况。

前辈们总是会告诉我们，拖尾峰与柱子有关，可能是过载，稀释样品再做，或换新柱做。有时候托尾峰往往是有机性相近杂质没有分开，此时，可以优化分析方法，或更换柱子试一试；也可能由于柱子使用时间太久柱效下降出现塌陷等原因；再有也会根样品本身性质有关，基团需要流动相中添加能与之结合优化峰形的化学物质，要根据具体情况而定。

4.色谱双峰产生的可能及判断和处理

液相上有一句经典的话说得好“出两个峰肯定不是一种物质，出一个峰不一定是一种物质”。

而色谱双峰指的是明是一种物质，但在色谱图中出现双峰，而表明含二种物质。我将这种情况分为四种原因。

1）色谱柱

如果你分析样品时发现每个色谱峰都双峰出现（出峰越快，双峰的可能性会减少），尤其采用单一纯物质时，可以肯定色谱柱出问题－柱头受损或柱头固定相变脏或流失。如果进样量少，原来色谱柱正常，色谱峰的形状多为一大峰带一小峰，不一定拖尾，这一般应是柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，一般情况下就行了。当然不反冲，正冲有时也会正常的。如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头固定相变脏或流失可能性更大，高频红外碳硫分析仪这是可以将进样那头拧开，将微孔滤片超声，柱头刮去一部分填料，重新填上新填料拧紧，不过这种活，需要一定技术，同时不能老干那种事，否则用不了几次，色谱柱就会应柱效很低而报废。

2）溶剂极性及进样量

许多HPLC分析者对此可能不以为然，一般的HPLC的书籍和文献都不会提到这方面的内容，而这确是双峰产生的一个很重要的原因。目前HPLC分析多为反相色谱，流动相多为甲醇、乙腈、水，加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解。最佳的溶解方法是用流动相溶解，但是很多情况是不一致的。当用溶剂极性强度大的试剂，如纯甲醇、纯乙腈，纯乙醇，而分析体系中以水为主，样品进样量大，如定量管为20ul，此条件下完全可以肯定，单一的纯物质出双峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一样），且拖尾，保留时间会提前（相对进样量少而言），将进样量减少一半以上，峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大，而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。上面提到进样量造成双峰的一个原因，另一个原因是，进样量不一定大，但绝对量很大，色谱图上的双峰紧靠在一起，基本上齐高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色谱柱问题）。将样品稀释再进样就可以了，这是由于进样量过大，色谱柱过载造成的。

3）样品的特性

有些样品由于其化学结构的特点，存在互变异构现象，而这种互变异构体无法分开，而是以一个动态平衡存在。在色谱分析时，在一个特定的条件下，一种物质将出现双峰，双峰靠的很近，基本齐高，不拖尾，条件稍一变化，尤其pH，双峰现象将消失，如红霉素等。有的样品紫外的色谱图上看不到双峰，但在LC－MS下，用质谱检测器，其质谱的总离子流图上较明显，例如我分析过的农药啶虫眯（吡虫清）。

4）参数

记录的参数一般都内定的，不必修改，但GC和HPLC的参数是不完全一致的，例如C－R3A数据记录仪上的一般记录时间间隔GC为2ms，HPLC为5ms，如果记录间隔时间缩短，一个峰将变为二个峰或更多。

5.鬼峰、倒峰、未出峰

6.峰裂分

裂峰产生原因的确定

?样品基质复杂或分析多种样品——柱污染或部分阻塞滤片

?流动相pH>=7——由于硅胶溶解导致柱塌陷(除非使用专门的柱子)

?溶剂比流动相的强度大——可能产生裂峰或宽峰，由样品量决定（溶剂化效应）

7.峰拖尾、峰展宽、峰前伸

峰拖尾原因的确定

?评价柱选择——使用高纯度硅胶柱或不同键合技术柱

?评价流动相效果——改变流动相pH和添加剂消除次级效应(流动相中组份与柱子相互作用)

?减小进样量

?消除柱外效应

?冲洗柱子——检查柱子老化/塌陷

易记小卡片来了：其它常见峰异常问题汇总

Q&A峰问答

进行HPLC分析时，怎样才能知道某一个色谱峰是否是单一峰呢？特别是分析中药成分的时候？标准品加入法、DAD、还有改变流动相的组成是否能说明呢？

1、多种不同原理的方法比较是首选。

2、其次采用DAD检测器进行光谱分析，如果提示不纯，估计有问题。纯度阈值受仪器、流动相等影响，所以只能作为参考。对于分子结构中差异有紫外吸收官能团的，dad检测器一般还是可以准确判断峰纯度的，但对于结构中无紫外吸收的那些差异，DAD检测器就无能为力了，比如某肽链中的氨基酸差异、或者一些对应异构体，dad也是无能为力的。

3、如果DAD不行，那么就需要采用质谱鉴别了，优选液质联用，如果是含盐流动相，可以采用收集不同时段的色谱流出物的方式，脱盐，进行质谱检测。

4、如果怀疑有异构体，这个就比较头疼了，非对应异构体需要二级（主要是对CID的能量有要求，可以打断侧链）的质谱才能判断侧链的区别。对应异构体的辨别目前好像只有waters的离子淌度质谱（没做过）有一定的分辨能力，但也不是万能的。

所以峰纯度判定需要结合化合物及可能杂质的结构特点，来合理选择。