液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱，或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱；反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团(ODS)称为C18柱，其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用：

一、反相色谱柱的选择

1．柱子的pH值使用范围　　

反相柱优点是固定相稳定，应用广泛，可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料，使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱pH值范围都在2-8，流动相的pH值小于2时，会导致键合相的水解；当pH值大于7时硅胶易溶解；经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况，色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时，建议选择pH范围大的柱子。

2．填料的端基封尾(或称封口)　　

把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾，可改善对极性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了，有利于不易保留化合物的分离；填料稳定性好了，组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物，最好选用填料经端基封尾的色谱柱。

二、液相色谱柱的使用　　

色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。在做柱性能测试时要按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同。

1、样品的前处理　　a、最好使用流动相溶解样品。　　b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不 可逆吸附的杂质。　　c、使用0.45—0.8μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。

2、流动相的配制　　

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间雷竞技百科 交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：　　a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。　　b、流动相与样品不产生化学反应　　c、流动相的黏度要尽量小，以便得到好的分离效果；降低柱压降，延长泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。　　d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。　　e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。 　　f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。　　

3、流动相流速的选择　　

因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1mL／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8mL／min为佳。　　当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。注意：　　a．含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲 溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。　　b．流动相要求使用0.45—0.8μm滤膜过滤，除去微粒杂质。　　c．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。

三． 色谱柱的维护

1. 色谱柱的平衡　　

反相色谱柱由工厂测试后是保存在乙腈/水中的。新柱应先使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈冲洗色谱柱。请一定确保您分析样品所使用的流动相和乙腈/水互溶。 每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！操作步骤：　　a. 平衡开始时将流速缓慢地提高，用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂流速如果较低，则需要较长的时间来平衡)　　b. 如果使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"即每天分析开始前必须先用纯水冲洗30分钟以上再用缓冲盐流动相平衡； 分析结束后必须先用纯水冲洗30分钟以上除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟保护柱子。

2． 色谱柱的再生　　

长期使用的色谱柱，往往柱效会下降(柱子的理论塔板数减低)。可以对色谱柱进行再生，在有条件的实验室应使用一个廉价的泵进行柱子的再生。　　　　

建议用来冲洗柱子的溶剂体积：　

　色谱柱尺寸 柱体积 所用溶剂的体积 　　

125-4mm 　 1.6mL 　 30mL　　

250-4 mm 　 3.2mL 　 60mL　　

250-10mm 　 20mL 　 400mL 　　

选择再生方法：　　极性固定相(如Si，NH2* ，DIOL基色谱填料)的再生：　　正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**　　非极性固定相(如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等)的再生：　　 水→乙腈→氯仿(或异丙醇)→乙腈→水注意：　　a. 在对-NH2改性的色谱柱进行再生时，由于-NH2可能以铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1mol/L的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。 　　b. 0.05mol/L稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱，如果简单的用有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，在水洗后加用0.05mol/L稀硫酸冲洗非常有效。

3. 色谱柱的维护 　　

a．使用预柱保护分析柱(硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度)　　

b．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围　　

c．避免流动相组成及极性的剧烈变化　　

d．流动相使用前必须经脱气和过滤处理　　

e．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存于甲醇或乙腈中　　

f．氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。