步骤是：先在培养皿中倒一层不含细菌的基本培养基，待冷凝后，加一层含菌的基本培养基；冷凝后，再加一层不含菌的基本培养基，经培养出现菌落后，在培养皿底上相应的位置做上标记，然后加一层完全培养基。再经培养后出现的菌落，多数是只能在完全培养基中生长的营养缺陷型，上、下两层基本培养基的作用是使菌落夹在中间，以免细菌移动或被完全培养基冲散。
