由于现代科学技术的发展,DNA合成已广泛采用DNA自动合成仪,仅有少数特殊情况下采用人工合成。目前,主要有ABI(Applied Biosystem Inc.)。Pharmacia、Backman等几家公司生产DNA/RNA合成仪,其中以ABI公司的仪器占我国及世界市场的80~90%。由于合成技术的现代化,人们已从繁重的劳动中得到解脱。输入合成仪的DNA序列,可以在数小时之内得到完成。我们所要做的工作只是合成柱取下,进行DNA切落和去保护基以及纯化,并进行量鉴定和计算合成率。
1. DNA合成仪的操作(略)
2. DNA原切落及去保护
取下DNA合成柱,置适量浓氨水(氢化铵,28%)中浸泡,一般为1ml氢氧化铵密封后55℃保温:~15小时,或70℃保温2小时,使合成的寡核苷酸片段从载体上切落并去除β-腈乙基磷酸保护基。
3.寡核苷酸片段的纯化
1).NAP柱纯化:由Pharmacia公司生产,主要成分为Sephadex G-25,经特殊处理后装成的不同体积的小柱常用的有NAP-10。含寡核苷酸片段的氨水溶液,调整体积为1ml加样于NAP-10柱上(使用前,以15ml双蒸水平衡柱子)以1ml双蒸水洗脱,收集洗脱下的液体,即为纯化的寡核苷酸,NAP-10柱可以纯化长度在10mer以上的寡核苷酸,产率在90%以上。经NAP-10柱纯化后样品中盐的含量少于3%,完全可以满足实验的需要。
2).丙烯酰胺凝胶电泳纯化,从合成柱上洗脱的寡核苷酸片段,冰冻、干燥、去氨水,溶于适量水中后,占样于15~20%丙烯酰胺凝胶制备胶上,按10V/cm条件电泳,过夜。电泳完毕后,取下凝胶于EB染色后观察,或直接将含寡核苷酸片段的凝胶置于硅胶荧光板上(CMC板)紫外线灯下,根据分子量的标准切下所需的区段
(呈黑色),将胶块置少量缓冲液(10mmol/L Tris?HCl,pH8.0,1mmol/L EDTA 300mmol/LNaCl),捣碎胶块,25~42℃浸泡过夜(4~24小时),或将胶块置于有少量缓冲液的透析袋中,通电下,寡核苷酸片段即进入透折袋中。洗脱的寡苷酸核片段以酒精沉淀、洗涤,真空抽干后即可应用。
浸泡法简单,成本低,易操作。电泳法较快,回收产率高,但需鉴定。此外还有HPLC(高效液相层析),及寡核苷酸纯合柱(OPC,ABI生产)等方法可以纯化寡核苷酸片段。可以根据手头的材料,仪器及使用习惯而加以选择。
4.寡核苷酸片段的鉴定
可以采用PAGE、HPLC、FPLC等方法对合成的寡核苷酸进行鉴定。对于10~100mer的寡核苷酸,可以用20%浓度的丙烯酰胺凝胶电脉,观察电泳区带即可判断合成片段的纯度及片段大小。如果结合5′或3′末端核素标记放射自显影技术则结果更加可靠。采用FPLC和HPLC鉴定合成片段的纯度,速度快,精确度高,但需昂贵的仪器设备。合成片段最精确的鉴定方法是采用Maxam-Gilbert化学法测定核苷酸序列。
5.合成产物中DNA含量的测定
4种碱基的平均最大吸收波长为260nm。一般选用该波长测定DNA含量。测定前,稀释样品,使光吸收在0.2~1.2OD范围内。在石英比色杯中测定样品溶液光密度。
表14-1合成寡核苷酸片段粗产量
合成柱规格(mmol) |
粗产量(OD260) |
0.2 |
20~25 |
1.0 |
100~125 |
10.0 |
800~1000 |
产量=OD260×25=OD260实测值×稀释倍数×体积×25(mg/ml)一般认为对单链寡核苷酸片段,1OD260=25mg/ml。
不同规格合成柱产量均不一样。