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RAPD操作要点

放大字体缩小字体发布日期:2006-07-06
        一、 材料
        不同来源的DNA(50ng/ul)。
        二、设备
        PCR仪,PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管,电泳装置。
        三、试剂
        1、随机引物(10mer) (5umol/L):购买成品。
        2、Taq酶:购买成品。
        3、10xPCR 缓冲液:配方见第八章。
        4、MgCl2 :25mmol/L。
        5、dNTP:每种2.5mmol/L。
        四、操作步骤:
        1. 在25ul反应体系中,加入
          模板DNA 1ul (50ng)
          随机引物 1ul (约5pmol)
          10xPCR Buffer 2.5ul
          MgCl2 2ul
          dNTP 2ul
          Taq酶 1单位(U)
          加ddH2O 至 25ul
        混匀稍离心, 加一滴矿物油。
        2. 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟, 36℃ 1分钟, 72℃ 1分钟,共40轮循环。
        3. 循环结束后, 72℃ 10分钟,4℃保存。
        4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于2% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100V(电压低带型整齐, 分辨率高)。
        5. 电泳结束,观察、拍照。
        [注意] 1、电泳时一般RAPD带有5-15条, 大小0.1-2.0kb。
            2、 特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。


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