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Southern印迹杂交

放大字体  缩小字体 发布日期:2006-07-06

  Southern blot 是研究DNA图谱的基本技术,在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后,经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段,然后经碱变性,Tris缓冲液中和,高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上,烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交,利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置,从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

  (1)琼脂糖凝胶电泳:利用琼脂糖凝胶电泳可以很容易地将DNA限制酶消化片段(0.3~25kb)分离开。分离大分子DNA片段(800~12000bp)用低浓度琼脂糖(0.7%),分离小分子片段(500~1000bp)用高浓度琼脂糖(1.0%),300~5000bp的片段则用1.3%的琼脂糖凝胶,根据分离样品量、分离速度和分辨率要求的不同,可选用不同规格的电泳槽。
  电泳时,同时将标记物加到旁边孔中,便于确定样品DNA的分子量。20伏恒压电泳过夜。电泳毕,将胶浸到含0.5μg/ml EB的TBE缓冲液中染色30min,也可将EB直接加到电泳缓冲液中或在配胶前加入胶中,在254nm短波透射灯下拍照,加橙黄色滤色镜,使用高速一次成像胶片,光圈f4.5,曝光20~40s。
  (2)硝酸纤维素滤膜吸印。
  ①将胶切成合适大小,切去右上角作为记号。
  ②将胶放进盛有变性缓冲液(1.5mol/l NaCl, 0.5mol/L NaOH)的盘中轻摇动15min。
  ③换到中和缓冲液(1mol/L Tris·HCl , pH8.0, 1.5mol/L NaCl)中轻摇动30min。
  ④裁一张硝酸纤维素膜,2~4张3MM滤纸和一些吸印纸(可用卫生纸),都与胶的大小相同(硝酸纤维素膜和吸印纸不能比胶大,否则易形成旁路),先将硝酸纤维素膜浸到水中,再放入10×SSC中,接触胶和硝酸纤维素膜时都要戴橡胶手套操作。
  ⑤平盘上放一块比胶大的平板(盛胶槽翻过来即可),上面铺一张3MM滤纸,起灯芯作用,盘中加少量10×SSC缓冲液(2.5cm厚),不能没过平板,使3MM滤纸充分饱和。
  ⑥将胶倒扣到3MM滤纸上。
  ⑦浸湿的硝酸纤维素铺在胶上,对齐,铺膜时从一边逐渐放下,防止产生气泡,有气泡时,可用吸管赶出,不能让膜与胶下的滤纸直接接触。
  ⑧膜上放一张3MM滤纸,不能与胶接触。
  ⑨上面加吸印纸及重物(500g左右)。
  ⑩通过滤纸的灶芯作用,平盘中的缓冲液就会通过胶上移,从而将DNA吸印到膜上,及时更换浸湿的吸印纸。在室温下转印过夜。
  ⑾去除上面的东西,用镊了将膜取出,在6×SSC中洗一下(也可不洗)。
  ⑿自然干燥,80℃烤2h。
  ⒀这时的膜就可进行杂交,或室温密封保存。

 
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