根据分离DNA片段的大小及需凝胶的容积,配制聚丙烯酰胺凝胶.
1.按要求装配好垂直电泳板,两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂 糖封边,防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.
2.将装好的玻璃电泳板倾斜成45~60℃角.
3.按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数.
4.加入TEMED后,立即混匀,缓缓倒入两玻璃板间的胶床中,直到液 体接近溢出时为止.
5.立即插入适当的梳子,密切注意防止梳齿下产生气泡,用一有力 的夹将梳子夹在一边的玻璃板上,然后将玻璃板斜靠在物体上,使 成10°角,可减少液体泄漏的机会.
6.室温聚合一小时后,将玻璃板插入电泳槽中,上紧,倒入0.1XTBE 缓冲液.
7.小心取出梳子,立即用缓冲液冲洗加样孔,因为梳子取出后,梳 子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合,产 生不规则的表面,将导致以后DNA电泳带型不规则.
8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后,加到样品孔内,加样时不 要产生气泡.
9.接好电极,电压为1-8V/cm,进行电泳.
10.根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳.
11.电泳毕,切断电源,弃去电泳仪,取出胶床板,小心移去一块玻 璃板,让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶 液中,15~30min后取出水洗紫外仪下观察结果.
12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出>10ng以上量的DNA条带.要求更高 的灵敏度,可用银染.