一、提取抗原蛋白
将提取RNA途中留存的样品，加入150μl 100%酒精充分混匀，静置5min(RT), 2000×g , 4℃离心5min,吸取上清至新管中,加入750μl异丙醇,混匀,静置10min(RT), 12000×g, 4℃离心10min,弃上清,加入1ml 0.3mol/L盐酸胍/95%酒精重悬沉淀,用加样器打散沉淀,混旋20~30秒,静置20min(RT) , 7500×g, 4℃离心5min,弃上清,重新加入1ml 0.3mol/L盐酸胍/95%酒精两次,重悬沉淀,离心后弃上清,加入100%无水乙醇1ml,混旋1min,静置20min(RT), 7500×g, 4℃离心5min,弃上清,真空干燥5min , 50μl 1%SDS溶解沉淀，用50℃热水助溶，直至全部溶解。10000×g,离心10min,去除沉渣。
二、蛋白定量
1.取PBS、各样品10 ul，加DW 990 ul
2.取DW匀浆缓冲液、样品稀释液、系列牛血清白蛋白标准浓度0.5 ml。
3.向各管加入2.5 mlD试剂（A50ml＋B0.5ml＋C0.5mlA－2%[陈星云1]Na2CO3、0.1NNaOH，B－0.5%CuSO4，C－1%酒石酸钠）混匀，静置10分钟。
4.迅速加入酚试剂0.25ml，混匀37℃水浴30分钟。
5.721分光光度计650 nm，比色，S0标准管调零。
6.最后稀释为4 ug /ul，加载样缓冲液后，终浓度为2ug / ul，上样量为30～80ug /泳道。
三、电泳
1.makegel．
11%分离胶12ml两块胶
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4%积层胶6ml两块胶
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DW4.36 ml
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DW堵漏3.66ml
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3MTris3.0 ml
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0.5MTris1.5 ml
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30%Arc4.4 ml
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30%Arc0.5 ml0.78 ml
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10%SDS0.24 ml
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10%SDS60 ul
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10%APS0.12 ml
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10%APS20ul30 ul
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TEMED10ul
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TEMED5ul6ul
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2.上样前样品处理：
样品100℃、3分钟、冷却，900×g、离心30 S。
3.通电电：积层胶电泳电压50V左右，分离胶电泳电压90～110V。
4.考马斯亮蓝染色：1小时，1号脱色1小时，2号脱色2小时。
四、电转印
1.将滤纸NcM切成与凝胶尺寸大小，置于DM中浸透5分钟，电转液平衡15分钟。
2.转移：用二张大滤纸贴于两张多孔垫料，将NcM、胶夹于中间，在NcM与大滤纸之间垫小滤纸。NcM朝正极，20V恒压转移12小时。取下NcM杂交，凝胶染色看效果。
五、杂交
1.取下NcM，做好标记，dH2O冲洗，室温滤纸干或放入膜固定液15分钟。
2.NcM用PBS冲洗二遍，呈5～6%non－fatmilk的pH7.2的PBS中封闭，室温６－８小时或室温1－2小时，4℃，过夜。
3.将封闭的膜用ＰＢＳ冲洗一遍，洗15分钟×1，5分钟×2。
4.加入一抗1:1000－1200，室温，反应1小时
5.PBS洗15分钟×1，15分钟×4。
6.加入二抗1:5000，室温，反应1小时。
7.PBS洗15分钟×1，5分钟×4。
六、化学发光试剂检测
1.混合等体积Bottle1&2与NcM共孵育1分钟。
2.放射自显影：曝光3分钟至10分钟。
3.显影后清水漂洗，再定影。
七、所用试剂
1、匀浆缓冲液4×1L：
NaH2PO4（·H2O）
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12.48g
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Na2PO4·12H2O |
114.6g
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NaCl
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3.6g
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dw 800ml, adjustpHto7.0,adjustVolto1 L
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（1）用时稀释4倍。
（2）40ml PBS＋PMSF 40 ul＋1.10phenautehroline80 ul＋Iodo80ul＋pepstalmA 80ul
2.系列牛血清蛋白浓度稀释法：
取500ug / ml BSA按下法配制：
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500ug / ml BSA
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NS
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蛋白浓度ug / ml
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S1
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50 ul
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1.95 ml
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12.5
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S2
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100 ul
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1.90 ml
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25
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S3
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200 ul
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1.80 ml
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50
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S4
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400 ul
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1.60 ml
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100
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S5
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800 ul
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1.20 ml
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200
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3.30瑀ylamide
29.2g单丙、0.8g双丙溶解于60 mlDDW，调Vol到100 ml
4.3MTris－HclbufferpH 8.9100ml.
称Tris 36.3g溶于水到100 ml，调pH到8.9
5.0.5 MTris－HclbufferpH 6.7100ml
称Tris5.98g溶解后，调pH到6.7，调体积到100ml
6.Samplesbuffer10ml
10%SDS
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2 ml
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甘油
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1 ml
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0.5MTris
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1.6 ml
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用前按9:0.5:加0.1溴酚兰、0.5% DTT贮备液。
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DDW
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5.2 ml
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7.电转液1LpH 8.2－8.3
Glycine
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14.42 g
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Trisbase
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3.02 g
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dH2O
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800 ml
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Methanol
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200 ml
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10% SDS
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2 ml
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8.pH 7.2PBS2 L
NaCl
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18.0g
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KCl
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0.44g
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Na2HPO4
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2.84g（7.16g）
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NaH2PO4
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0.432g（0.562g）
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加DW到2 L
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9.10×电极缓冲液400 mlpH 8.4
Tris base
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12.2 g
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甘氨酸
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57.76 g
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加DW 400 ml,调pH8.4，用前加SDS0.1%
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10.脱色液1号
甲醇
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250 ml
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冰醋酸
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50 ml
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＋DW到500 ml
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11.脱色液2号
甲醇
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100 ml
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冰醋酸
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75 ml
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＋DW到1000 ml
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