菌落原位杂交(colony in situ hybridization)。是将细菌从一主平板转移到硝酸纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落裂菌以释放出DNA,将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号、并与主平板上的菌落对位。
实验步骤如下:
①将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上,用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和主琼脂平板上,排列成方格栅,膜和板上菌落位置相同。
②培养细菌至产生1-2mm大小的菌落。
③在一块平皿中置4张滤纸,用10%SDS浸透,倒掉多余液体,将带有菌落的滤膜取下轻轻置于滤纸上,菌落面在上,注意防止滤膜底面存有气泡。
④5min后,将滤膜转至用变性溶液(0.5mol/L NaOH,1.5mol/LNaCl)浸湿的滤纸上,放置10min。
⑤将滤膜转至中和溶液(1.5mol/L NaCl, 0.5mol/L Tris-HCl
pH8.0)浸湿的滤纸上,放置10min,重复中和一次。
⑥将滤膜移至用2×SSPE溶液浸过的滤纸上,放置10min,SSPE配成20×贮备液:3.6mol/L NaCl,0.2mol/L
NaH2PO4(pH7.4),20mmol/L EDTANa2(pH7.4)。
⑦将滤膜用滤纸吸干,80℃真空烘干2h。