Southern印迹杂交

Southern印迹杂交（Southern blot）是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着，附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置，从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
（1）琼脂糖凝胶电泳。利用琼脂糖凝胶电泳可以很容易地将DNA限制酶消解片段（0.3～25kb）分离开，分离大分子DNA片段（800-12000bp）用低浓度琼脂糖（0.7%），分离小分子片段（500～1000bp）用高浓度琼脂糖（1.0%），300-5000bp的片段则用1.3%的琼脂糖凝胶。根据分离样品品质，分离速度和分辨率要求的不同，可选用不同规格的电泳槽。电泳时，同时将分子量标记物加到旁边孔中，便于确定样品DNA的分子量。20伏恒压电泳过夜，电泳完毕，将胶浸到含0.5μg/ml EB的TBE缓冲液中染色30min，也可将EB直接加到电泳缓冲液中或在灌胶前加入胶片中，在254nm短波透射灯下拍照，加橙黄色滤色镜，使用高速一次成像胶片，光圈f4.5，曝光20-40s。
（2）硝酸纤维素膜吸印。
[1]将胶片切成合适大小，切去右上角作为记号。
[2]将胶片放进盛有变性缓冲液（1.5mol/L NaCl,0.5mol/L NaOH）的盘中轻晃15min。
[3]换到中和缓冲液（1mol/L Tris-HCl,pH8.0,0.15mol/L NaOH）的盘中轻晃30min。
[4]裁一张硝酸纤维素膜、2-4张3mm滤纸和一些吸印纸（可用卫生纸），都与胶的大小相同（硝酸纤维素膜和吸印纸不能比胶大，否则易形成旁路）。先将硝酸纤维素膜浸到水中，再放入10×SSC缓冲液,接触胶和硝酸纤维素膜时都要戴手套操作。
[5]平盘上放一块比胶大的平板上面铺一张3mm滤纸,起灯蕊作用,盘中加入少量10×SSC缓冲液（2.5cm厚），不能没过平板，使3mm滤纸充分饱和。
[6]将胶倒扣在3mm滤纸上。
[7]浸湿的硝酸纤维素膜在胶上，对齐。铺膜时从一边逐渐放下，防止产生气泡，有气泡时，可用吸管赶出，不能让膜与胶下的滤纸直接接触。
[8]膜上放一张3mm滤纸，不能与胶接触。
[9]上面加吸印纸及重物（500g左右）。
[10]通过滤纸的灯芯作用，平盘中的缓冲液就会通过胶上移，从而将DNA吸印到膜上，及时更换浸湿的吸印纸，在室温下转印过夜。
[11]清除上面的东西。用镊子将膜取出，在6×SSC中洗一下。
[12]自然干燥，80℃烤2h。
[13]这是的膜就可进行杂交，或室温密封保存。