(一)滤膜的准备
提取基因组(染色体)DNA
用适当限制性内切酶(如BamHI、EcoRI、HindIII或Pst I)消化DNA,
重蒸水 11µl
基因组DNA 5µl(3-5µg)
10×缓冲液 2µl
限制性内切酶 2µl
总量为20µl
3. 37℃条件下保温10-24小时。
4. 取2µl样品在0.7-1%凝胶上在TBE溶液中进行电泳检查。
5.确定后,样品与DNA分子量标准一起胶电泳。
6.电泳结束后,在凝胶的侧沿放一把直尺进行拍照,并做标号。
7.将电泳凝胶用蒸馏水冲洗后,放入100ml depurination solution中,室温条件下缓慢振动浸泡15min。(胶显黄色)
8.凝胶蒸馏水冲洗后,转移到100ml 变性溶液中缓慢振动浸泡20分钟,换新的变性溶液,再振动浸泡20分钟。(胶显蓝色)
9.水洗凝胶后,转移到中和溶液缓慢振动浸泡15,然后换溶液后,再浸泡15min。
10.毛细管作用,将DNA从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。
取出杂交尼龙膜,在其上面做上记号,在6×SSC溶液中非常缓慢转动条件下清洗5min。(含有DNA面朝上)将其从溶液中取出,放在Whatman 3MM滤纸上,让其自然风干。 夹在两张滤纸中,放在80℃条件下烘烤2小时,使其完全固定。
(二)探针的标记
1、取10ng-30g DNA,,用双蒸水定容至15μl.
2、在沸水浴中变性DNA 10 min,迅速放入冰浴中。
3、在变性DNA中添加下列试剂
六聚寡核苷酸 2μl
dNTP标记混合物 2μl
Klenow enzyme 1μl
总体积20μl
4、混匀、少许离心后,在37℃条件下培养。
5、添加2μl的0.2 EDTA(PH8.0),或者65℃加热10分钟终止反应。
(三)杂交:
1、预热适当体积的DIG Easy Hyb (2ml/100cm2膜)
2、在合适的容器中,预杂交膜30min,柔和摇动,预杂交。
3、在沸水浴中5min,变性大约25mg/ml的DIG标记DNA探针,然后迅速在冰浴中冷却。
4、倒去杂交液,添加探针和杂交液到膜,在缓慢振动情况下保温杂交6h或者过夜。
5、用洗液Ⅰ(2*ssc,0.1℅SDS)在室温条件下洗2次,每次15min。
6、用预热的洗液Ⅱ(0.5*ssc,0.1℅SDS),在65-68℃的条件下,摇动洗2次,每次15min。
(四)免疫检测:
1、 杂交后,洗液中漂洗膜1-5min
2、 在100ml终止液中(blocking solution),保温30min。
3、 在200ml抗体溶液(Antibody solution)中保温30min。
4、 用100ml洗液洗2次,每次15min。
5、 用20ml检测液平衡2-5min。
6、 在黑暗中,加10ml colorsubstrate 溶液于适当容器中,保温。在显色的过程中不要摇动。(淡色的反应开始在几秒钟,在16小时后完全反应)
7、 膜曝光后短时间内检测显色
8、 用ddH2O或者TE buffer洗膜,终止反应。