（一）在丰富培养基中扩增质粒
许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pＭＢl或ＣolEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物２－５mg质粒ＤＮＡ，而且重复性也很好。
１）将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（ＯＤ600约0.6)。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。
２）将含相应抗生素的500ml ＬＢ或Terrific肉汤培养基（预加温至37℃）施放入25ml对数晚期的培养物，于37℃剧烈振摇培养25小时（摇床转速300转/分），所得培养物的ＯＤ600值约为0.4。
３）可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇）， 使终浓度为170μg/ml。像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒（如pUC质粒）可复制达到很高的拷贝数，因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。但用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。
４）于37℃剧烈振摇（300转/分），继续培养12-16小时。
（二）细菌的收获和裂解
１．收获
１）用Ｓorvall ＧＳ3转头（或与其相当的转头）于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。
２）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的ＳＴＥ中。
STE
0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
２）按步骤１）所述方法离心，以收集细菌细胞。
２．煮沸裂解法
该法[根据Ｈolmes和Ｑuigley(1981)的方法修订而成] 可与随后的纯化步骤如氯化钯－溴化乙锭梯度平衡离心等步骤联合使用。建议该法只用于经氯霉素处理的培养物，未处理的培养裂解后过于粘稠，不利操作。当从大肠杆菌ＨＢ101或其衍生质粒（包括ＴＧ1）中大量提取质粒时，不宜采用煮沸法。这些细菌释放大量糖类，在氯化铯－溴化乙锭梯度中与闭环ＤＮＡ形成密度大致相同的区带。这些糖类还抑制以ＤＮＡ为模反或底物的酶。
１）将500ml 培养物的细菌沉淀物[ 从上述步骤３）获得] 重悬于用冰预冷的10mlSTET中。
STET
0.1MOL/l nAcl
10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
1mmol/L EDTA(pH8.0)
5% Triton X-100
将悬液移入50ml锥瓶中。
２）加入1ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,沉吟于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。如溶液的pH值低于0.8溶菌酶不能有效地发挥作用。
３）用一个夹子把锥瓶放在本生灯的明火上加热，直至液体恰好开始沸腾，不停地摇晃锥瓶。
４）立即把瓶浸入装有沸水的大烧杯（2L）中，将瓶放在沸在水中，时间恰为4秒。
５）将瓶浸入用冰预次序的水中５分钟，使之冷却。
６）将粘稠状内容物从瓶中转移到超离心管（Beckman SW41或与其相当的管），于4℃以30 000转/分离心30分钟。原有的细菌增减物生长得越密，应越难将粘稠状裂解物转移到离心管中。如有绝对必要，可用长刀片和剪刀将裂解物剪成大小适于操作的大团块，或轴入10ml注射器的针筒中使之部分剪切。从经用氯霉素处理的细菌培养物中分离质粒ＤＮＡ时，一般不会出现这一问题。如细菌碎片未能形成紧密的团块，可以35 000转/分再度离心20分钟， 然后尽可能将上清转移到另一管内，弃去残存在管内的粘稠状液体。
７）将上清转移到另一管内，纯化质粒ＤＮＡ
３，ＳＤＳ裂解法
本法[根据Ｇodson和Ｖapnek(1973)的方法修订而成]的产量要低得多，是提取大质粒（大于15kb）的首选方法。
１）将来自500ml培养物的细菌沉淀物[来自收获细菌的步骤３）] 洗过后重悬于10ml用冰预冷10%蔗糖、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)溶液中，将些悬液移至30ml的带盖螺口塑料试管[橡树岭（Oak Ridge)型]中。
２）加2ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值小于8.0时，溶菌酶不能有效地发挥作用。
３）加8ml 0.25mol/L EDTA(pH8.0), 将管倒置数次以混匀悬液， 在冰上放置10分钟。
４）加4ml 10% ＳＤＳ，马上用一玻棒迅速混匀内容物，使ＳＤＳ均匀分散到整个细菌悬液中，操作应尽可能温和小心，以便最大限度地避免释放出来的ＤＮＡ受到剪切。
５）立即加入6ml 5mol/L NaCl（终浓度为1mol/L）， 再次用玻棒温和地然而却是彻底地混匀内容物，在冰上放置至少１小时。
６）于4℃用Beckman Ti50型转头（或与其相当的转头）以30 000转/分钟，去掉高分子量ＤＮＡ和细菌碎片。小心将上清转移到一个50ml的一次性塑料离心管中，弃去沉淀物。如果细菌碎片贴壁不紧，可用35 000转/分再度离心20分钟， 然后尽可能将上清转移到另一管中，去掉存在离心管内的粘稠状液体。
７）上清用酚：氯仿和氯仿各抽提１次。
８）将水相转移到－250nl的离心瓶中，于室温加入２倍体积的（约60ml ）乙醇，充分混匀，于室温放置1-2小时。
９）于４℃下以5000g离心20分钟，回收核酸。
10）充上清，于室温用70％乙醇洗涤沉淀物，按步骤９）离心，尽可能地去除乙醇，将离心管倒置于纸巾上，使最后残存的乙醇流干，在真空干燥内短时间干燥沉淀物，但不要使之完全干燥。
11）用3mlTE(pH8.0)溶解ＤＮＡ。
12）通过氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心纯化质粒ＤＮＡ。用聚乙二醇纯化质粒时，经过几次沉淀步骤，大质粒（大于15kb）容易产生切口，所以氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法是纯化这种质粒的首选方法。
４，碱裂解法
该法是Ｒ．Ｔreisman尚未发表的方法，同时也是Brinboim和Ｄoly(1979)及Ｉsh-Horowicz和Burke(1981)所用方法的改进。该方法对于目前使用的所有大肠菌菌株都卓有成效，并可与随后的纯化步骤，如骤乙二醇沉淀或氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心等，一并联合使用。注：括号中给出的体积可适用于未经氯霉素处理的培养。
１）将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[ 来自收获细菌的步骤３）] 重悬于10ml（18ml
）溶液Ｉ中。
溶液Ｉ
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)
溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于４℃。
２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。
当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。
３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）
1％ＳＤＳ
盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。
４）加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
水 28.5ml
所配成的溶液对钾是３mol/L，对乙酸根是5mol/L。
封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体ＤＮＡ、 高分子量ＲＮＡ和钾－ＳＤＳ－蛋白质－膜复合物。
５）用ＳorvallＧＳ3转头（或与其相当的转头）于４℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟， 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分[步骤４）]。
６）用４层干酪包布把上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。
７）用Ｓorvall GS3转头（或与其相当的转头）于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于４℃离心，盐也会了生沉淀。
８）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。
９）用３ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。
10）用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心或聚乙二醇沉淀。
