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等电聚焦电泳技术

放大字体缩小字体发布日期:2006-06-28 浏览次数: 115
      (一)原理
      等电聚焦技术是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术。
      本法的分辩率极高,所以在进行等电聚焦电泳时,要求样品不能过于复杂,一般应经其他方法(如层析法)提纯后再进行等点聚焦,才能得到比较满意的结果。如利用人的纯IgG再经过等电聚焦电泳,可以满意地分离IgG的四个亚类。如IgG 2浓缩于pH7.0的部位,IgG 3浓缩于pH8.0~9.0的范围内,IgG 4则浓缩于pH6.0以下的部位,而IgG则分布于全部pH范围,且只有IgG 1能存在于pH9.0以上的部位。
      等电聚焦电泳与其他分离方法结合起来,将是一项很有前途的分析鉴定和制备样品的好技术。
      (二)器材与试剂配制
      1.聚焦柱 有成品出售,分110ml和440ml两种。
      2.电源 0V~1 200V可调20W的直流稳压电源。
      3.载体两极电解质 市售25ml瓶装,浓度为40%或20%(W/V),pH范围为2.5~11,也有其它pH范围的,可根据实验条件选择购买。
      4.蔗糖(分析纯)
      1. 电极液的配制见表:
      表 正电极缓冲液的配制
      正极在中心管内
      正极在柱顶
      磷酸
      或硫酸
      0.05(0.2)ml或1(4)ml
      1Mol/L 酸溶液
      0.025(0.1)ml或0.5(2)ml
      1Mol/L 酸溶液
      H 2O
      15(56)ml
      5(25)ml
      蔗糖
      11(44)g
      表2-3 负极缓冲液的配制
      负极在中心管
      负极在柱顶
      氢氧
      化钠
      0.1(0.4)g或1(4)ml
      0.05(0.2)g或0.5(2)ml
      2Mol/L 溶液
      2Mol/L 溶液
      蒸馏水
      14(56)ml
      5(25)ml
      蔗糖
      11(44)g
      此配制用量为最大用量,一般用1/5的量即可。括号内为440ml聚焦柱型号所用量配方。
      6.重、轻液的配制与混合
      ⑴重、轻液的配制:配制方法见表:
      表 重、轻液的配制方法
      110ml柱
      440ml柱
      载体40%(ml)
      水及蛋白质溶液(ml)
      蔗糖(g)
      重液
      1.9
      37
      26
      轻液
      0.6
      51.5
      重液
      7.6
      148
      104
      轻液
      2.4
      206
      此表为梯度混合器所用量,如用手工混合法则应相应适当增加20%。
      ⑵重、轻液的混合:有条件的可采用梯度混合器装柱。手工混合法操作如下:取24支试管(440ml聚焦柱则应取46支试管)按2-5表各加入重、轻液,充分混匀。
      试管号
      重液(ml)
      轻液(ml)
      试管号
      重液(ml)
      轻液(ml)
      1
      2
      3
      4
      5
      6
      7
      8
      9
      10
      11
      12
      4.6
      4.4
      4.2
      4.0
      3.8
      3.6
      3.4
      3.2
      3.0
      2.8
      2.6
      2.4
      0.0
      0.2
      0.4
      0.6
      0.8
      1.0
      1.2
      1.4
      1.6
      1.8
      2.0
      2.2
      13
      14
      15
      16
      17
      18
      19
      20
      21
      22
      23
      24
      2.2
      2.0
      1.8
      1.6
      1.4
      1.2
      1.0
      0.8
      0.6
      0.4
      0.2
      0.0
      2.4
      2.6
      2.8
      3.0
      3.2
      3.4
      3.6
      3.8
      4.0
      4.2
      4.4
      4.6
      (二)操作方法
      1.决定电极的极性 如pH梯度范围在6以下时,则聚焦柱底的电极为正极。如pH梯度的范围在6以上时,则柱底为负极。原因是蔗糖浓度越大,电导越小,所以在等电点pH6~7的载体处,应该避免蔗糖浓度最大的部位。
      2.装柱 按电极的极性与电极液的要求装柱。将聚焦柱垂直放置,先注入底部电极液,打开中心管下端的活塞,从中心管上端,用带长胶管的注射器注入电极液,使液面在中心管下部开口处之上达1cm处即可。
      3.注入载体溶液 加完后应使电极液仍浸没中心管的下部开口,不使电极与载体溶液直接接触。
      4.加重、轻混合液 从1号试管加起,用注射器沿管壁缓缓加入,流速约3ml/min,全部重、轻混合液加完后,再在上部加电极液,使上部电极浸没。
      5.连接冷凝水管。
      6.电泳 电压300V。开始电泳时,由于载体分子都不处于等电状态,所以它们都带电,在电场影响下向各自的等电点移动,因此开始时电流较大,以后逐渐减小。所以在开始时电压可稍低一些。电泳结束时电流约为0.30mA,电泳时间2~3天。
      7.样品的收集 断电后,关闭中心管下端活塞以免电极液流出,放入样品,流速2ml/min为宜。以部分收集器收集,每管2ml。
      8.测每管的pH值和蛋白含量,将相近pH的同一蛋白质的管合并。
      9.将分离的每一样品成分过SepHadexG25(或G50),将蛋白质与载体分离开来。

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