(一)原理
等电聚焦技术是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术。
本法的分辩率极高,所以在进行等电聚焦电泳时,要求样品不能过于复杂,一般应经其他方法(如层析法)提纯后再进行等点聚焦,才能得到比较满意的结果。如利用人的纯IgG再经过等电聚焦电泳,可以满意地分离IgG的四个亚类。如IgG
2浓缩于pH7.0的部位,IgG
3浓缩于pH8.0~9.0的范围内,IgG
4则浓缩于pH6.0以下的部位,而IgG则分布于全部pH范围,且只有IgG
1能存在于pH9.0以上的部位。
等电聚焦电泳与其他分离方法结合起来,将是一项很有前途的分析鉴定和制备样品的好技术。
(二)器材与试剂配制
1.聚焦柱 有成品出售,分110ml和440ml两种。
2.电源 0V~1 200V可调20W的直流稳压电源。
3.载体两极电解质 市售25ml瓶装,浓度为40%或20%(W/V),pH范围为2.5~11,也有其它pH范围的,可根据实验条件选择购买。
4.蔗糖(分析纯)
1. 电极液的配制见表:
表 正电极缓冲液的配制
正极在中心管内
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正极在柱顶
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磷酸
或硫酸
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0.05(0.2)ml或1(4)ml
1Mol/L 酸溶液
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0.025(0.1)ml或0.5(2)ml
1Mol/L 酸溶液
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H
2O
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15(56)ml
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5(25)ml
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蔗糖
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11(44)g
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表2-3 负极缓冲液的配制
负极在中心管
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负极在柱顶
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氢氧
化钠
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0.1(0.4)g或1(4)ml
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0.05(0.2)g或0.5(2)ml
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2Mol/L 溶液
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2Mol/L 溶液
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蒸馏水
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14(56)ml
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5(25)ml
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蔗糖
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11(44)g
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此配制用量为最大用量,一般用1/5的量即可。括号内为440ml聚焦柱型号所用量配方。
6.重、轻液的配制与混合
⑴重、轻液的配制:配制方法见表:
表 重、轻液的配制方法
110ml柱
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440ml柱
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载体40%(ml)
水及蛋白质溶液(ml)
蔗糖(g)
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重液
1.9
37
26
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轻液
0.6
51.5
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重液
7.6
148
104
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轻液
2.4
206
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此表为梯度混合器所用量,如用手工混合法则应相应适当增加20%。
⑵重、轻液的混合:有条件的可采用梯度混合器装柱。手工混合法操作如下:取24支试管(440ml聚焦柱则应取46支试管)按2-5表各加入重、轻液,充分混匀。
试管号
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重液(ml)
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轻液(ml)
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试管号
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重液(ml)
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轻液(ml)
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1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
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4.6
4.4
4.2
4.0
3.8
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6
2.4
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0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
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13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
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2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
|
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
4.0
4.2
4.4
4.6
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(二)操作方法
1.决定电极的极性 如pH梯度范围在6以下时,则聚焦柱底的电极为正极。如pH梯度的范围在6以上时,则柱底为负极。原因是蔗糖浓度越大,电导越小,所以在等电点pH6~7的载体处,应该避免蔗糖浓度最大的部位。
2.装柱 按电极的极性与电极液的要求装柱。将聚焦柱垂直放置,先注入底部电极液,打开中心管下端的活塞,从中心管上端,用带长胶管的注射器注入电极液,使液面在中心管下部开口处之上达1cm处即可。
3.注入载体溶液 加完后应使电极液仍浸没中心管的下部开口,不使电极与载体溶液直接接触。
4.加重、轻混合液 从1号试管加起,用注射器沿管壁缓缓加入,流速约3ml/min,全部重、轻混合液加完后,再在上部加电极液,使上部电极浸没。
5.连接冷凝水管。
6.电泳 电压300V。开始电泳时,由于载体分子都不处于等电状态,所以它们都带电,在电场影响下向各自的等电点移动,因此开始时电流较大,以后逐渐减小。所以在开始时电压可稍低一些。电泳结束时电流约为0.30mA,电泳时间2~3天。
7.样品的收集 断电后,关闭中心管下端活塞以免电极液流出,放入样品,流速2ml/min为宜。以部分收集器收集,每管2ml。
8.测每管的pH值和蛋白含量,将相近pH的同一蛋白质的管合并。
9.将分离的每一样品成分过SepHadexG25(或G50),将蛋白质与载体分离开来。