二步法：EnVision System
EnVision显色系统是将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体（即
EnVision）直接放大信号40-50倍，把传统的二抗、三抗分别孵育合为一次孵育。特点：敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生物素干扰）。
EnVision工作程序：
1） 脱蜡、水化组织切片。
2） 预处理组织切片（据一抗具体说明而定）
3） 蒸馏水漂洗，置于TBS中。
4） 阻断内源性过氧化物酶（仅用于EnVisionTM/HRP）
5） 蒸馏水漂洗，置于TBS，10分钟
6） 一抗孵育10-30分钟
7） TBS漂洗10分钟
8） EnVisionTM孵育10-30分钟
9） TBS漂洗10分钟
10) 色源底物溶液孵育10分钟
11) 蒸馏水漂洗
12) 复染及封片
免疫染色方法
The basic principles of ICC
? 抗原抗体反应
? 标记化学反应
? 呈色化学反应
要求
待检标本形态结构
和抗原性保存良好,
抗原不从原位扩散
或丢失
Specimen preparation
取材新鲜，固定及时，形态保存完好，抗原物质的抗原性不丢失、不扩散和被破坏
? Fixation
? Sample Type
Cryostat (frozen) sections
Paraffin Sections
Antigen Retrieval Techniques
? Intention: To facilitate the immunological reaction of antibodies with antigens (increase reactivity of the majority of antigens) .
Antibody Staining
? Primary antibody may be directly labeled
? labeled secondary antibody or more complex detection system.
? secondary antibody against the immunoglobulins of the primary antibody source
减少或消除非特异性染色的方法
? 最常见原因 蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上
? 最有效方法
1. 在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清（1:5-20）10-20min，
2. 加入2-5%牛血清白蛋白可进一步减少非特异性染色，
3. 用除制备第一抗体以外的其它动物血清（非免疫的）
对照实验
主要是针对第一抗体对照，常用方法：
? 阳性对照：已知阳性
? 阴性对照：
1.已知阴性
2.空白对照 BS代替特异性抗体
3.替代对照:用同种属正常血清代替特异性抗体
4.吸收实验:先用抗原吸收一抗
5.抑制实验:先用未标记抗体,再用标记抗体
6.置换实验:用无关的特异性抗体代替一抗
Antibody Detection
? There are several different methods that can be employed to detect antibodies bound to tissue, depending upon whether the label used is enzymatic or fluorescent.
1. Fluorescence
2. Enzyme-Mediated Detection
3. 亲和组织化学（Affinity histochemistry）
1. Fluorescence
Directly Indirectly
直接法 间接法
补体法
双标法
使用荧光显微镜的注意事项
? 暗室
? 点燃汞灯5-15min,稳定后再开始观察
? 光源寿命有限,应集中观察,防止反复点燃,灯熄后应充分冷却才能再次点燃,一次观察时间不能太长,以2-3h内为宜
? 标本染色后应尽快观察,存放在4C能延缓荧光衰减,标本不能长时间暴露于紫外线
荧光显微镜标本制作要求
1.载玻片:厚度均匀,0.8-1.2mm之间,光洁,无自发荧光
2.盖玻片:厚度0.17mm,光洁
3.标本:不能太厚
4.封裱剂:无自发荧光,无色透明,pH8.5-9.5,常用甘油和0.5mol/L pH9.0-9.5碳酸盐缓冲液等量混合
5.镜油:无荧光镜油,或甘油或液体石蜡
2.Enzyme-Mediated Detection
直接法(Direct)
间接法 (Indirect)
基本原理
? 以间接法法为例
? 一抗是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体（80-90%多抗由家兔制得，单抗由小鼠制备）
? 二抗为一抗（IgG）的抗体。
? 优点：只要一抗来自同一种属，同一标记的二抗就能用来显示不同的抗原，避免了直接法标记每一种一抗，提高了敏感度。
酶标抗体法的特点
? 用于标记的酶应具备以下几点:
1.酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，易于光、电镜观察
2.所形成的终产物必须稳定,不能弥散
3.较易获得,价廉,最好已商品化
4.组织中不应存在内源性酶或类似物质
5.酶应稳定,标记后保持酶和抗体的活性
缺点 酶与抗体共价结合损害部分抗体和酶的活性
三步法(HRP labelled)
多层反应法
Alkaline Phosphatase - Anti-Alkaline Phosphatase (APAAP) Technique
过氧化物酶抗过氧化物酶法(Peroxidase Antiperoxidase ,PAP法)
? 原理与酶桥法相似
? 制备PAP复合物: 使抗HRP抗体与HRP形成可溶性复合物
PAP复合物的特征
? 在抗原稍过量时,所有抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物
? PAP复合物的形状相当稳定,不受抗原量的影响
? PAP复合物中HRP/抗HRP抗体的比例为3:2,即由3个HRP分子与2个抗HRP抗体组成,呈五角形结构
PAP法的评价
? 抗体活性高:非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性
? 灵敏度高:3个酶分子对应1个抗原
? 不适合免疫电镜 AP复合物分子量大
? 背景染色低
假阴性及其处理
假阳性及其处理
1.组织细胞内色素: 如神经黑色素,可用AKP代替HRP
2.假过氧化物酶活性: 如RBC内的血红素辅基,用甲醇-0.3%H2O2预处理15-20min(室温)
3.内源性过氧化物酶活性: 如粒细胞、巨噬细胞等，用AKP代替HRP
4.游离醛基: 与蛋白质(含IgG)非特异性结合,用白蛋白预孵育封闭之
5.疏水键和离子键: Ig可通过疏水键和离子键与组织中的碱性蛋白或Fc受体非特异性结合,用正常血清(首选制备二抗的种属)于一抗前孵育封闭之
6.天然抗体及不纯抗体: 增加一抗稀释度
7.载体蛋白抗体: 制备半抗原的抗体时,使用了载体蛋白,用固相吸收技术将载体蛋白抗体除去
增加染色强度方法
1.重复显色
2.重复一抗
3.双桥PAP法
亲和组织化学（Affinity histochemistry）
? 新技术的出现----新进展
? 特点 一些具有双价或多价结合力的物质如植物凝集素(Lectin)、生物素（Biotin）和葡萄球菌A蛋白（Staphylococcal protein, SPA）等被应用于ICC，其共同特点是以一种物质对某种组织成分具有高亲和力为基础。它们既有别于古老的组织化学的分解、置换、氧化和还原，本质上又非抗原抗体反应。称为亲和组织化学（Affinity histochemistry）。广义的亲和组织化学包括：
抗原与抗体、植物凝集素与糖类、生物素与抗生物素、 SPA与IgG、阳离子与阴离子、配体与受体等。
? Avidin-Biotin interactions or other commercially-available amplifiers
生物素-抗生物素基本原理
? Avidin 卵白素，统称为抗生物素或亲和素 a basic glycoprotein，MW 68 Kd
? biotin 生物素，small water soluble vitamin （vitamin H），MW 24Kd，
? Avidin(卵白素)具有4个同biotin(生物素)亲和力极高（较抗原抗体高100万倍）的结合点。能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。同时它们都具有与其它示踪剂结合的能力。
抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术(Avidin Biotin-Peroxidase Complex technique,ABC技术)
ABC法的评价
advantages
1.敏感性强:亲和力强
2.特异性强:一抗和二抗工作浓度低
3.时间缩短
4.多重标记
注意事项
1.内源性生物素活性:如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺，预先用0.01%的抗生物素和0.01%生物素分别作用20min，每次作用后PBS5minX3次
2.差异大,注意厂家、批号
3.4C保存
Disadvantages of ABC
1.ABC的IP约为10, 中性pH时带正电荷,容易与nucleus等带负电荷结构非特异结合.
2.Avidin是glycoprotein, 与lectins等分子通过碳水化合物连接
? 通过用streptavidin(抗生蛋白链霉素) 代替avidin克服上述缺陷.
? Streptavidin: a protein (MW 60 Kd) isolated from the bacterium Streptomyces avidinii(链霉亲生物素蛋白), and like avidin, has four high affinity binding sites for biotin. IP接近中性,在中性pH时很少带电荷, not a glycoprotein and therefore does not bind to lectins.
桥抗生物素-生物素技术(Bridged Avidin-Biotin technique, BRAB技术)
标记生物素-抗生物素技术(Labelled Avidin-biotin technique,LAB技术)