这一方法需要用蔗糖或甘油制备轻微的连续密度，然后将待分离的样品加在离心管的最上层，形成一狭窄的带，再通过较长时间的离心。在离心过程中，大小、形状、密度不同的颗粒就会分开，最后收集各区带得到要分离的物质。在此方法中，分离介质对被分离的物质必须是中性无害的，并且密度梯度较低，底部的密度比管顶部的密度大，建立密度梯度的目的是防止扩散。重要的是，待分离颗粒的密度比离心管中任何部分介质的密度都要大。常用的是蔗糖密度梯度离心(sucrose density gradient centrifugation)。