手机版
最近，小编在按照标准方法《GB 5009.121-2016 食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定 第二法 液相色谱法》做不同的食品基质中脱氢乙酸的检测实验时发现，标准方法中处理果汁、烘焙食品、黄油等样品的操作流程非常繁琐、耗时长、误差不可控的步骤过多，且回收率不理想。
因此，小编依据脱氢乙酸的性质对实验过程进行改动优化，发现使用P-SAX小柱（强阴离子交换柱）具有“化繁从简”的神奇效果，大大提升做样速度和回收效果~
以下是方法优化过程碰到的问题和一些思考分享，以供各位朋友参考交流。
净化方法的选择
首先，小编归纳了国家标准中的不同基质样品的提取、净化方法。
果蔬汁、果蔬浆类样品：
酱菜、发酵豆制品类样品：
面包、糕点、焙烤食品馅料、复合调味料类样品：
黄油类样品：
不难看出，国标的处理方法核心思路为：碱性溶液提取，提取液用甲酸调节pH后净化。部分类型样品的净化方法包括液液萃取（LLE）与固相萃取（SPE），如液液萃取法净化后上机结果不理想，则使用C18小柱进行固相萃取。
我们都知道，耗时更短是SPE法相比LLE法的优势之一，且国标方法中也提及，如果LLE法效果不理想可使用SPE法，说明SPE法净化效果更有保证。
为了使检测方法更加快速高效，小编使用固相萃取法作为净化方法。
接下来小编将以国标方法12.1.1 为例进行方法验证与方法优化。
方法验证
为验证国标方法中C18小柱的保留效果，小编先使用脱氢乙酸标准溶液进行方法验证，确保现有实验条件下，目标化合物使用该方法能被有效回收，才能用来进行样品处理。
参考的国标方法如下：
实际操作中，小编做了两个处理：
1、净化处理：将脱氢乙酸标液按12.1.1步骤净化，收集洗脱液过滤上机。
2、未净化处理：等浓度标液作对照直接上机检测。
来看一下经过净化和未经过净化的样液脱氢乙酸的回收结果：
（注：蓝色峰为脱氢乙酸标准溶液，黑色峰为洗脱液）
不难看出，收集到的洗脱液吸收峰变形严重。
考虑到两者基质溶剂不同，需要考察溶剂对峰形的影响。
因此小编又取一定量的标准品储备液，分别用水、70%甲醇溶液配制成浓度为1ppm的上样溶液，上机测定结果，谱图如下：
（其中蓝色峰为纯水基质，黑色峰为70%甲醇基质）
由图可知，直接使用洗脱液上机会存在溶剂效应，需要将洗脱液中的甲醇除去，因此小编在洗脱步骤之后增加氮吹过程去除甲醇。
令小编沮丧的是，除去甲醇后，回收率仍然不理想（15.35%）。小编收集了上样、淋洗步骤的流出液上机检测，发现目标物未被检出。结合上述实验结果看，导致目标物回收率低的情况可能出现在提取环节或固相萃取洗脱环节，目标物可能仍保留在小柱上。
然而，整个操作过程实在太繁琐、太不确定！再去追究哪一步出现问题要花大量时间！
综合整个操作流程，涉及两个调pH步骤，引入的误差无法准确控制；样品提取液较少的时，繁琐的操作难免导致目标物损失。一方面，检测结果准确度不好保障，另一方面，繁琐的流程限制了做样速度，增加方法改良的时间成本。这样的方法即便有效也难实现大批量样品的快速处理。
那么换个思路进行方法优化如何？
方法优化
小编想，既然原有操作复杂、回收效果也不理想，那么能否通过更换更合适的SPE小柱，实现对方法的整体优化，达到准确，高效的实验效果？
小柱的选型要由目标物性质决定，小编首先看了一下脱氢乙酸的化学性质：
脱氢乙酸是吡喃的衍生物，常温下呈晶体状。脱氢乙酸晶体难溶于水，在甲醇中溶解度5%（w/w，25℃），水溶液弱酸性，饱和溶液pH=4。其盐类脱氢乙酸钠在水中溶解度较大。
脱氢乙酸
脱氢乙酸钠
这里小编发现，脱氢乙酸是一种有机弱酸，其离子化状态是弱阴离子。那么，如果能使脱氢乙酸在提取和固相萃取富集环节保持离子化状态，是否可以利用离子交换机制选择小柱呢？
考虑至此，小编选定了月旭P-SAX小柱（强阴离子交换柱）作为SPE净化柱。使用P-SAX小柱回收脱氢乙酸时，需要注意两个环节：
碱性环境中上样（脱氢乙酸离子化，被小柱吸附）；
酸性环境中洗脱（脱氢乙酸变回中性分子，失去与小柱间的作用力，被洗脱）。
优化后
在进行了进一步优化后，最终的实验步骤、谱图、回收率如下（以洋葱基质为例）：
▍1、提取：
称取2g样品于50mL离心管，加入5mL氢氧化钠溶液（1mol/L），定容至25mL，涡旋混匀2min，超声提取15min，8000r/min离心5min，上清液待净化。
▍2、净化
SPE柱：月旭Welchrom? P-SAX，规格：200 mg/6mL。
活化：5mL甲醇，5mL水，弃去
上样：10ml待净化液上样，弃去
淋洗：5mL水，弃去，抽干
洗脱：5mL10%甲酸甲醇，收集于15ml离心管中，抽干
浓缩：40℃氮吹至约200μL，用水定容至2ml，过0.45μm水系滤膜后上HPLC检测。
▍3、仪器条件
色谱柱：月旭Ultimate?XB-C18, 4.6×250mm, 5μm
流动相：0.02mol/L乙酸铵（pH=10）：甲醇=35:65
柱温：35℃
进样量：20μL
检测波长：484nm
流速：1.0mL/min
改进后的提取步骤避免了国标方法中两次调节pH的繁琐，操作快速、回收率更加理想。
小编后来又用黄油、辣条、面包、青团等样品做了验证，回收率和RSD均十分理想。
总结
在进行脱氢乙酸的检测中，按方法开发步骤分别进行了洗脱液、SPE小柱类型、前处理方法优化。因此在某种目标物检测方法改进时，需要针对目标物性质、SPE机制、实验整体流程三个方面进行，且每一个步骤都需要摸索出最佳条件，从而得出一个稳定、高效的检测方法。
文章（文字）来源：网络。
