1.3. 控制菌检验方法验证

当建立药品的微生物限度检查时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的的控制菌检查方法测定。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应进行重新验证。验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。

1.3.1.验证用菌株

大肠埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】

金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】

乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】

验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0 代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

1.3.2.菌液制备

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，35～37℃培养18～24小时；分别取培养液 1ml加0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，制成每1ml含菌数10～100cfu的菌悬液。

1.3.3. 阴性菌对照组

设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。

1.3.4.试验组

1.3.4.1.常规法

◆ 大肠埃希菌 取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌 10～100cfu，35～37℃培养18～24小时，取此培养物按《微生物限度检查SOP》大肠埃希菌项下规定检查。

◆大肠菌群 取含适量（不少于10ml）的胆盐乳糖发酵培养基管3支，分别加入含供试品1g或1ml 、0.1g或0.1ml、含供试品0.001g或0.001ml的供试液，阳性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌 10～100cfu，35～37℃培养18～24小时，按《微生物限度检查SOP》大肠菌群项下规定检查。

◆沙门氏菌取供试品10g或10ml，直接或处理后接种至适量（不少于200ml）的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，阳性菌对照加入沙门菌 10～100cfu，阴性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时。按《微生物限度检查SOP》沙门菌项下规定检查。

◆铜绿假单胞菌 取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入铜绿假单胞菌10～100cfu，阴性菌对照加入大肠埃希菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时。按《微生物限度检查SOP》沙门菌项下规定检查。

◆ 金黄色葡萄球菌 取相当于1g或1ml供试品的供试液至100ml胆盐乳糖培养基中，阳性菌对照加入金黄色葡萄球菌10～100cfu，阴性菌对照加入大肠埃希菌 10～100cfu，35～37℃培养18～24小时。按《微生物限度检查SOP》金黄色葡萄球菌项下规定检查。

1.3.4.2. 培养基稀释法 供试品有抑菌作用，放大培养基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器体积限制，一般放大到500ml或1000ml，本法适用于抑菌作用不强的样品。

1.3.4.3. 薄膜过滤法 采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。

1.3.4.4. 离心沉淀集菌法 取规定量供试液，如供试液含许多药渣，先以500转/分钟离心3~5分钟，取全部上清液，再以3000转/分离心20分钟，取下面1ml液体，并将适量的稀释剂洗涤管底的洗涤液一并移入同瓶增菌液中，培养，本法适用于中度抑菌作用的样品。

1.3.4.5.中和法 在供试品溶液中加入相应的中和剂，以减除供试品中抑菌成分的作用，中和剂应对微生物无毒性，与抑菌成分结合后的产物应对微生物亦无毒性，或有毒性但不影响待检菌的检出。

1.3.5.结果判断

至少应进行3次独立平行试验。阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，照该供试液制备方法和控制菌检查法进行该供试品控制菌的检查；若试验组未检出试验菌，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

2.验证的实施

2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证记录及控制菌检验方法验证记录(见附件)。

2.2.分析数据，综合整个验证过程，得出验证结论。

2.3.验证过程中发生的异常情况，按照《偏差处理程序》进行处理。

3.相关文件

《微生物限度检查SOP》

4.再验证

4.1.药品的组分发生改变可能影响检验结果时。

4.2.验证时检验条件发生改变可能影响检验结果时。