将抗原结合到抗体微珠基质上的最简单方法是将微珠装到一个层析柱内，将抗原溶液流经层析柱，当抗原流经层析柱时结合到抗体上而被固定，直到洗脱时才洗脱下来。这种方法的效率是根据抗原与固定的抗体之间的接触时间决定的，所以抗原抗体之间的作用时间可以用低流速而延长。

1．准备工作

开始前，要考虑层析柱的类型和大小选择微珠。如果微珠的柱床体积宽和浅比窄和高的柱床洗脱出来的峰尖，而且这样较容易将微珠移到另一个容器中储存。太宽的层析柱的缺点是当改变洗脱缓冲液时微珠易扩散。

2．所需溶液和特殊设备

PBS；

简单的层析装置。

3．操作步骤

（1）将抗体微珠转移到一个合适的层析柱中，用20倍柱床体积的PBS洗脱。

（2）将抗原溶液加到层析柱中，让溶液以一个较缓慢的速度（约lml／hr每毫升柱床体积），可以用一个泵控制流速。

（3）用20倍柱床体积的结合缓冲液洗涤层析柱。

此层析柱可用于进一步洗涤或洗脱。

4．常见问题

这种方法最大一个问题就是某些蛋白非特异性结合到分离柱上，这些蛋白可以出现在洗脱液中，从而使纯化效率降低。基质本身和抗体基质复合物具有与待检抗原溶液中蛋白质非特异性结合的表面活性。虽然这些反应较正常的抗原—抗体反应要弱得多，但抗原溶液中如存在大量额外的非特异性蛋白即意味着在此过程中将产生内在的高本底。为了尽可能减少非特异性吸附，可以采取以下几种措施。

首先，如采用各种亲和柱纯化法，所用基质的量须调整到略高于其饱和水平。保持抗体—微珠—基质的体积，使非特异性本底尽可能降低。捕获大量抗原所需抗体—微珠基质的量与流速有关。流速较慢时，柱容量更有效，因为偶联的抗体就有更多时间与抗原结合。

第二种方案是降低柱上的非特异性吸附量。许多吸附到柱基质上的蛋白质是部分或全部变性的蛋白。当制备抗原溶液时，机械性压力应尽可能小，并避免过度与空气接触。降低抗体柱上非特异结合的一种较好的方法是将抗原溶液通过一个未与抗体偶联的琼脂糖柱，此层析柱应与抗体—微珠基质柱体积相同或更大。另外一种引起非特异性结合的因素来自小颗粒碎片被阻留在柱基质上。将抗原溶液经过100 000g离心30min，可以去除制品中大多数较大的凝聚物。

第三种降低本底的方法是用缓冲液洗涤层析柱以去除非特异性蛋白。任何不干扰抗原抗体反应的缓冲液都可以用于阻止非特异性结合。