一.原理

“化学键合相色谱法”——采用化学键合相作固定相的液相色谱法。

化学键合相是利用化学反应通过共价键将有机分子键合在载体（硅胶）表面，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相。其分离机理为吸附和分配两种机理兼有。对多数键合相来说，以分配机理为主。

通常，化学键合相的载体是硅胶，硅胶表面有硅醇基，≡Si–OH，它能与合适的有机化合物反应，获得各种不同性能的化学键合相。

从键合反应的性质可分为：酯化键合（≡Si-O-C）、硅氮键合（≡Si-N）和硅烷化键合（≡Si-O-Si-C）等；硅烷化键合相应用最广泛。这种键合相是用有机氯硅烷与硅醇基发生反应：

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≡Si–OH +C₁₈H₃₇SiCl₃→≡Si-O–Si–C₁₈H₃₇+ HCl

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这种固定相在pH = 2～8.5范围内对水稳定，有机分子与载体间的结合牢固，固定相不易流失稳定性好。

十八烷基硅烷键合相（Octadecylsilane简称ODS或C₁₈）：是最常用的非极性键合相。它们用于反相色谱法，在70℃以下和pH 2～8范围内可正常工作。

化学键合固定相具有如下优点：

①柱效高：传质速度比一般液体固定相快；

②稳定性：耐溶剂冲洗，耐高温，无固定液流失，从而提高了色谱柱的稳定性和使用寿命；

应用范围广：改变键合有机分子的结构和基团的类型，能灵活地改变分离的选择性，适用于分离几乎所有类型的化合物；且能用各种溶剂作流动相（梯度洗脱）。

二.流动相

化学键合相色谱所用流动相的极性必须与固定相显著不同，根据流动相和固定相的相对极性不同分为：

1.正相键合相色谱法：流动相极性小于固定相极性。

常用非极性溶剂如烷烃类溶剂，样品组分的保留值可用加入适当的有机溶剂（调节剂）的办法调节洗脱强度。常用有机溶剂为极性溶剂如氯仿、二氯甲烷、已腈、醇类等。

适用于分离中等极性化合物，如脂溶性维生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有机氯农药等。

2.反相键合相色谱法：流动相极性大于固定相极性。

流动相多以水或无机盐缓冲液为主体，再加入一种能与水相混溶的有机溶剂（如甲醇、乙睛、四氢呋喃等）为调节，根据分离需要，改变洗脱剂的组成及含量，以调节极性和洗脱能力。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。

固定相一般为C_18、C₈。

反相键合相色谱法应用最广泛，因为它以水为底溶剂，在水中可以加入各种添加剂，改变流动相的离子强度、pH值和极性等，以提高选择性，而且水的紫外截至波长低，有利痕量组分的检测，反向键合相稳定性好，不易被强极性组分污染，且水廉价易得，安全。