一、肉毒梭菌

1、生物学状性

　　肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，具有该菌的基本特性，即厌氧性的杆状菌，形成芽胞，芽胞比繁殖体宽，呈梭状，新鲜培养基的革兰氏染色为阳性，产生剧烈细菌外毒素，即肉毒毒素。

　　肉毒梭菌为多形态细菌，约为4×1μm的大杆菌，两侧平行，两端钝园，直杆状或稍弯曲，芽胞为卵圆形，位于次极端，或偶有位于中央，常见很多游离芽胞。有时形成长丝状或链状，有时能见到舟形、带把柄的柠檬形、蛇样线装、染色较深的球茎状，这些属于退化型。当菌体开始形成芽胞时，常常伴随着自溶现象，可见到阴影形。

　　肉毒梭菌具有4-8根周毛性鞭毛，运动迟缓；没有荚膜。

　　在固体培养基表面上，形成不正圆形，大约3毫米左右的菌落。菌落半透明，表面呈颗粒状，边缘不整齐，界线不明显，向外扩散，呈绒毛网状，常常扩散成菌苔。在血平板上，出现与菌落几乎等大或者较大的溶血环。在乳糖卵黄牛奶平板上，菌落下培养基为乳浊，菌落表面及周围形成彩虹薄层，不分解乳糖；分解蛋白的菌株，菌落周围出现透明环。

　　肉毒梭菌发育最适温度为25-35℃，培养基的最适的酸硷度为pH6.0-8.2。

　　肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同性，也常见到株间的差异。（见表1）

表1 各型肉毒梭菌的生化反应

型 别 反 应	A	B	C	D	E	F
葡萄糖发酵 麦芽糖发酵 乳糖发酵 蔗糖发酵 靛基质产生 胆胶液化 牛奶消化	＋ ＋ － （±） － （＋） ＋	＋ ＋ － （±） － （＋） （±）	＋ （±） － （±） （－） （±） －	＋ （±） （－） （±） （－） （±） －	＋ （＋） － （±） － （±） －	＋ ＋ － （±） － （＋） （＋）

注：+阳性反应；-阴性反应；（±）视菌株而异；（+）多为阳性反应；（-）多为阴性反应。

2、肉毒梭菌的致病性

　　肉毒梭菌的致病性在于所产生的神经毒素即肉毒毒素，这些毒素能引起人和动物的肉毒中毒，根据肉毒毒素的抗原性，肉毒梭菌至今已有A、B、C（1、2）、D、E、F、G等七个型。引起人群中毒的，主要有A、B、E三型。C、D二型毒素主要是畜、禽肉毒中毒的病原。F、G型肉毒梭菌极少分离，未见G型菌引起人群的中毒报道。

3、流行病学

　　肉毒梭菌广泛存在于自然界，引起中毒的食品有腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头食品等。在美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼制品较多，在我国主要以发酵食品有关，如臭豆腐、豆瓣酱、面酱、豆豉等。其它也引起中毒的食品还有：熏制未去内脏的鱼、填馅茄子、油浸大蒜、、烤土豆、炒洋葱、蜂蜜制品等。

　　肉毒梭菌是致死性最高的病原体之一。感染剂量极低，每个人都易感。摄食18-36小时后发病为典型病症，但不典型的可在4小时至8天不等。症状为虚弱、眩晕、伴随视觉成双、渐进性说话障碍、呼吸和吞咽困难。也许会出现腹胀和便秘。毒素最终引起麻痹，呈渐进对称性、自上到下

　　肉毒梭菌在自然界的分布上具有某种区域性差异，显示出生态上的差别倾向。A、B型的分布最广其芽胞广泛分布于自然界，各大洲的许多国家均有检出，；C、D型的芽胞一般多存在于动物的尸体中，或在腐尸附近的土壤中；E型菌及其芽胞存在于海洋的沉积物、水产品的肠道内，E型菌及其芽胞适应于深水的低温，使E型菌在海洋地区的广泛分布。但是，越来越多的调查结果表明，除G型菌之外，其它各型菌的分布都是相当广泛的。

二、肉毒毒素

1、生物学性状

　　肉毒梭菌的致病性在于其产生的神经麻痹毒素，即肉毒毒素，而细菌本身则是一种腐生菌。各个型的肉毒梭菌分别产生相应的毒素，所以，肉毒毒素也分为A、B、C、D、E、F、G等七个型。C型包括C1、 C2二个亚型。

　　A型毒素经60℃2分钟加热，差不多能被完全破坏，而B、E二型毒素要经70℃2分钟才能被破坏；C、D二型毒素对热的抵抗更大些；C型毒素要经过90℃2分钟加热才能完全破坏，不论如何，只要煮沸1分钟或75℃加热5-10分钟，毒素都能被完全破坏

　　肉毒毒素对酸性反应比较稳定，对碱性反应比较敏感。某些型的肉毒毒素在适宜条件下，毒性能被胰酶激活和加强。

2、致病性

　　肉毒毒素的毒性极强，是最强的神经麻痹毒素之一，据称，精制毒素1微克的毒力为200，000小白鼠（20克）致死量，也就是说，1克毒素能杀死400万吨小白鼠，一个人的致死量大概1微克左右。

3、流行病学

　　肉毒中毒是由于误食含有肉毒毒素的食品而引起的纯粹的细菌毒素食物中毒。人的肉毒中毒发生并不多，但是发病急、病程发展快、病死率高。肉毒中毒是毒素中毒，潜伏期较短，一般为6至36小时，最长60小时。主要症状有：视力减弱、全身无力、伸舌和张口困难、抬头费力、瞳孔散大、呼吸麻痹等。

　　据统计，1899年至1990年，在美国共有2305人中毒，经检测，303人感染A型毒素，92人感染B型毒，3人感染E型毒素，2人感染F型毒素，有2起中毒事件是由A、B二种毒素引起。F、G二种毒素，主要引起动物肉毒中毒，尚未深入得到研究。

　　重症患者，如果不及时治疗和抗毒素特异治疗，多在2至4天死亡。肉毒梭菌生长和产毒的最适温度是25至30℃，而在人的体温条件下细菌表现为丝状，几乎不能产毒、芽胞也不会发芽。

　　肉毒中毒一年四季均可发生，发病主要与饮食习惯有着密切关系。欧美国家主要的中毒是由于肉类食品、罐头食品引起；日本等沿海国家主要的中毒是由于进食水产品引起；我国内地的中毒主要是由于进食发酵食品（如：臭豆腐、豆瓣酱、豆豉等）引起的。

三、肉毒毒素检出及肉毒梭菌检验

A、肉毒毒素的检出

　　肉毒中毒的诊断，重要的是毒素的检出及定型；罐头食品的细菌学检验，有时需要证实肉毒梭菌的存在，不过，最终还是要根据产毒试验来鉴定细菌及其型别。

B、肉毒毒素检测的主要程序

1.初步的定性试验----小白鼠腹腔注射法

　　检验样品经适当处理后取上清夜，用明胶磷酸缓冲液稀释（1：5、1：10、1：100三个稀释度）后各取0.5毫升腹腔注射小白鼠；另取上清夜100℃10分钟加热后注射小白鼠；另取上清夜经胰酶处理后注射小白鼠；每个注射样注射二只小白鼠；注射后，定时观察小白鼠，连续观测48小时；排除24小时后死亡的白鼠和无症状死亡的小白鼠；48小时后，如果除了经热处理后再注射样品的小白鼠未死亡，其余小白鼠均死亡的情况，重复试验，增加稀释倍数，计算最底致死量。并进行抗毒素中和试验。

2.中和试验

　　用无菌生理盐水溶解冻干的抗毒素，，取A、B、E、F四种抗毒素注射于小白鼠体内；同时取未注射抗毒素的小白鼠做对照；注射抗毒素30分钟或1小时后，注射不同稀释度（覆盖10、100、1000倍最小致死量）的含毒素样品，观察48小时，如发现毒素未被中和，再取C、D型抗毒素和A-F多价抗毒素重复上述试验；如小白鼠死亡，应将含毒素样品稀释后再重复以上试验。

3．试验的几个注意事项

3.1典型的肉毒中毒，小白鼠会在4至6小时内死亡，而且98-99%的小白鼠会在12小时内死亡，因此，试验前24小时内的观察是非常重要的。

3.2 24小时后的死亡是可疑的，除非有典型的症状出现。

3.3如果小白鼠注射经1：2或1：5倍数稀释的样品后死亡，但注射更高稀释度的样品后未死亡，这也是非常可疑的现象，一般为非特异性死亡。

3.4小白鼠要用不会抹去的颜料加以标记。

3.5小白鼠的饲料与水必须及时添加、充分供应。

4.结果分析

4.1食物中发现毒素，表明未经充分的加热处理，可能引起肉毒中毒。

4.2检出肉毒梭菌，但未检出肉毒毒素，不能证明此食物会引起肉毒中毒。

4.3肉毒中毒的诊断必须以检出食物中的肉毒毒素为准。

4.4中和试验可以为毒素定型。

C、肉毒梭菌的检验与分离鉴定

　　肉毒梭菌检验方法的重点乃是产毒及毒素的检出试验，如要证实是否有肉毒梭菌存在，只要分离、培养、毒素鉴定即可。

1.前增菌

　　样品分别接种于疱肉培养基、TPGYT培养基，并分别与35、26℃培养7天。

2.分离

　　培养7天后，染色、镜检，观察菌的形态是否为典型的肉毒梭菌。取1-2毫升培养物加等量的酒精混合（或80℃加热10分钟，）后在室问温下培养1小时，非蛋白分解型的肉毒梭菌，因其芽胞不耐热，不要采取热处理的方法。

　　用接种环涂划酒精处理液或热处理的培养物于小牛肝卵黄琼脂或厌氧卵黄琼脂平板上，厌氧培养48小时，35℃。

　　典型菌落是隆起或扁平，光滑或粗糙，在卵黄培养基上用斜光检验时菌落表面通常出现虹晕色（iridescence）,此光区称为“珍珠层”，C、D、E型菌通常有2-4毫米黄色沉淀区围绕，A、B型菌通常显示较小的沉淀区。

　　挑取10个典型菌落，分别接种于疱肉培养基、TPGYT培养基，并分别与35、26℃培养7天，再取培养物按照1.2.1、1.2.2的方法进行肉毒毒素的检测即可。

　　生化反应试验，可以为鉴定做参考，以上肉毒梭菌的培养、分离、鉴定试验力求迅速，不要长时间接触空气，最好在厌氧条件下操作。

四、控制：

　　最根本的预防方法是加强食品卫生管理，改进食品的加工、调制及储存方法，改善饮食习惯，对某些水产品的加工可采取事先取内脏，并通过保持盐水浓度为10%的腌制方法，并使水活度低于0.85或pH为4.6以下，以及对于在常温储存的真空包装食品采取高压杀菌等措施，以确保抑制肉毒梭菌产生毒素，杜绝肉毒中毒病例的发生。