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GB 4789.40-2024《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺检验》为上述标准之一。标准于2024年2月8日发布，将于2024年8月8日正式实施。
本文通过对比克罗诺杆菌检验2024版与2016版标准，使读者更好地了解2024版修订的变更，以便更好地掌握克罗诺检验的发展方向。
一、简要说明
本标准与GB4789.40-2016相比主要变化如下：
--修改了标准名称，删除了阪崎肠杆菌，修改为“食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌检验”。
--标准适用范围增加了婴幼儿辅助食品;
--增加了PCR鉴定方法作为选做内容;
--删除了挑取黄色菌落和生化鉴定中的产黄色素和苦杏仁苷项目;
--修改了培养基和试剂pH调节方法;
--修改了预热、选择性增菌温度以及TSA平板的培养温度和时间;
--修改了生化反应的培养温度及氨基酸培养基的制备。
二、变化详情
本标准规定了食品中克罗诺杆菌(Cronobacterspp)的检验方法。
本标准适用于婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、乳及乳制品及其原料中克罗诺杆菌的检验。
增加婴幼儿辅助食品
2016版
2024版
1.删除25度恒温培养箱；恒温水浴温度范围调整，由原来的44℃±0.5℃调整为41.5℃±1℃；
2.增加0.01感量的天平；无菌锥形瓶修改为无菌容器；
3.增加PCR检测方法的所用到的PCR仪、离心机、电泳仪、反应管、离心管、接种环等设备和材料。
2024版
2016版
1.阪崎肠杆菌显色培养基变更为“克罗诺杆菌显色培养基”与标准名称对应；
2.增加PCR检测方法的培养基和试剂
2016版
2024版
1.ST-Vm增菌液培养温度变更为“41.5℃±1℃”；
2.修改了预热、选择性增菌温度以及TSA平板的培养温度和时间
3.增加PCR鉴定（选做），可节省检测时间
5.1前增菌和选择性增菌
取检样 100g(mL)置于无菌容器中,加入900mL已预热至41℃±1℃的 BPW,用手缓缓地摇动至检样充分溶解后,36℃±1℃培养18h±2h。轻轻摇动混匀培养过的前增菌液,移取1mL转入10mLmLST-Vm肉汤中,41.5℃±1℃培养 24h±2h。
1.无菌锥形瓶改为“无菌容器”；
2.为避免温度较高损伤细菌，前增菌BPW的预热温度由44℃修改为41 ℃。
3.44℃的选择性增菌温度可能抑制部分损伤的克罗诺杆菌生长，容易导致污染样品被漏检。ISO22964-2017标准已对选择性增菌温度由 44 ℃±0.5 ℃修改为41.5 ℃±1 ℃。且在制定标准过程中的验证试验结果也显示，mLST-Vm肉汤经41.5 ℃培养后检测结果优于44 ℃。因此，GB4789.40新版标准中选择性增菌温度修改为41.5 ℃±1 ℃。
5.2 分离
5.2.1 轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物,使用10μL接种环各取1环增菌培养物,分别划线接种于2个克罗诺杆菌显色培养基平板,36℃±1℃培养24h±2h,或按培养基要求条件培养。
5.2.2 可疑菌落按显色培养基要求进行判定,每个平板挑取至少 5个可疑菌落(不足5个时挑取全部可疑菌落) ,分别划线接种于TSA平板,36℃±1℃培养 24h±2h。
1.分离用的接种环指出其为10μL的，更明确；
2.显色培养基的名称前后对应起来，删除了“显色培养基须符合GB4789.28的要求”，个人觉得这是个漏点。
3.修改了TSA平板的培养温度和时间，由原来的25℃±1℃，培养48h±4h修改为“36℃±1℃培养 24h±2h”。
3.增加PCR鉴定方法：随着微生物检验对快速方法的检测需求， GB标准中引入PCR法，即可节省检测时间，减少工作量，又可以提高结果的准确性，实现对可疑菌落高通量的筛选。
5.4确证试验
选做5.3时,自PCR结果阳性的TSA平板上挑取菌落进行生化鉴定, PCR结果阴性的TSA平板不再进行生化鉴定。
未选做 5.3时 ,直接将 5.2.2的可疑菌落接种TSA平板后进行生化鉴定。
可以首先鉴定克罗诺杆菌显色培养基平板上最具特征性的菌落接种的TSA平板上的菌落。如果是阳性,则不需要测试其他TSA平板上的菌落。如果是阴性,则选取其他TSA平板上的菌落进行鉴定,直到全部为阴性或发现阳性菌落为止。为确保结果的准确性,对TSA平板上的菌落进行鉴定时,应使用新鲜的传代菌落。克罗诺杆菌的主要生化特征见表3。
上述鉴定也可选择商生化特征见表3。上述鉴定也可选择商品化生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统进行 。
1.步骤名称由鉴定修改为“确证试验”；
2.删除了挑取黄色菌落和生化鉴定中的产黄色素项目，因为在文献报道和实际检测中发现部分克罗诺杆菌不产黄色素，因此在新版标准中删除了该步骤及生化鉴定中产黄色素项目的操作；
3.删除苦杏仁苷生化反应；
4.强调做生化实验的菌落一定要新鲜培养物，如果为阴性，需要继续则选取其他TSA平板上的菌落进行鉴定,直到全部为阴性或发现阳性菌落为止。
6 结果与报告
根据菌落特征、确证试验(生化鉴定)和/或PCR鉴定结果,报告 100g(mL)样品中检出或未检出克罗诺杆菌。
1.修改了文字描述；
7 操作步骤
7.1 样品的稀释
取检样100g(mL)、10g(mL)、1g(mL)各3份,分别置无菌容器中,分别加入900mL、90mL、9mL已预热至41℃±1℃的BPW,用手缓缓地摇动至检样充分溶解,制成1:10样品匀液,36 ℃±1℃培养18h±2h。轻轻摇动混匀培养过的前增菌液,分别移入1mL转入10mLmLST-Vm肉汤,41.5℃±1℃培养24h±2h。
1.修改了检测方法的名称；
2.同第一法一样修改前增菌、增菌的培养温度；
3.修改可了样品处理的描述分固体和半固体、液体放在一起更简洁。
7.2 分离、鉴定
同5.2、5.3和5.4。
8 结果与报告
综合菌落特征、确证试验(生化鉴定)或 PCR鉴定结果,根据检出克罗诺杆菌的阳性管数,查MPN检索表,报告100g(mL)样品中克罗诺杆菌的MPN值(见附录C中表 C.1) 。
1.修改了培养基和试剂pH值调节方法，要求pH值灭菌后测定；
2.修改了相应的培养基名称及增加PCR检测用的试剂配制方法。
3.修改了氨基酸培养基的制备。
