平板划线分离法:是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面，通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

为方便划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20mL培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有分区划线法和连续划线法两种（如图1， A、B）。

图1

2）分区划线法

取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。

分区划线法分离时平板分四个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120°左右。

先将接种环沾取少量菌在平板1区划3~5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60~70°，右手把接种环上多余菌体烧死，将烧红的接种环在平板边缘冷却，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60~70°，同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，同上法培养，在划线区观察单菌落。

该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。

（1）左手平托两支试管，拇指按住试管的底部。外侧一支试管是斜面上长有菌苔的菌种试管，内侧一支是待接的空白斜面，两支试管的斜面同时向上。用右手将试管塞旋松，以便在接种时容易拔出。

（2）右手拿接种环（如握毛笔一样），在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌．

（3）将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指和掌心将两支试管的试管塞一并夹住拔出，试管塞仍夹在手中，然后让试管口缓缓过火焰。注意不得将试管塞随意丢于桌上受到沾污，试管口切勿烧得过烫以免炸裂。

（4）将已灼烧的接种环伸入外侧的菌种试管内。先把接种环的先端触及无菌苔的培养基上使其冷却（如果操作迅速，此时接种环尚未完全冷却）。再根据需要用接种环沾取一定量的菌苔，注意勿刮破培养基。将沾有菌苔的接种环迅速抽出试管，注意勿使接种环碰到管壁或管口上。

（5）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管的底部，轻轻向上划线（直线或曲线，根据需要确定），勿划破培养基表面。

（6）接好种的斜面试管口再次过火焰，试管塞底部过火焰后立即塞入试管内。

（7）将沾有菌苔的接种环在火焰上烧红灭菌。先在内焰中烧灼，使其干燥后，再在外焰中烧红，以免菌苔骤热，会使菌体爆溅，造成污染。

（8）放下环后，再将试管塞旋紧，在试管外面上方距试管口2～3cm处贴上标签。

斜面接种方法及无菌操作过程如下具体操作过程见图3。

图3

用接种针经火焰灭菌，沾取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后将挑起菌落的接种针平行于管壁插入琼脂斜面底部、沿着原接种线将针拔出、烧试管塞和试管口、塞上试管塞，再将接种针上残留的菌体在火焰上烧掉。要做到手稳、动作轻巧快速。见下图4。（a:垂直接种法，b：水平接种法）

图4