了解细菌革兰氏染色原理，并掌握其方法。

二、原理

革兰氏染色法是一种重要的鉴别细菌的方法，根据各种细菌对这种染色法的反应不同，可把细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两大类。因此，该方法对于细菌的分类，鉴定及生产应用都有重要意义。其染色原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同，革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇脱色处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性能降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫色；而革兰氐阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，脂类含量较高，经乙醇处理后，脂类被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，使细胞脱色。此时，再经复红或沙黄等红色染料复染细胞呈红色。

在革兰氏染色中，有两个值得注意的问题。一是酒精脱色的时间要掌握恰当，随涂片
厚薄不同，脱色的时间也不完全一样，一般以不溶出色素为止。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌，而脱色不够时阴性菌则被误染为阳性菌。二是培养物的老幼对染色结果也有影响，革兰氏染色检查的菌，必须是新培养物。

三、材料

1.菌种培养10~12h的枯草杆菌及大肠杆菌。

2.仪器及其他显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、玻片架、75%酒精消毒缸、镊子、无菌水、草酸铵结晶紫、Lugol氏碘液、95%洒精、蕃红染液、吸水纸、特种蜡笔。

四、方法与步骤

1.涂片涂片、干燥、固定同简单染色法。

2.初染滴加草酸铵结晶紫于涂片部位，染色时间为1min。
3.水洗用水轻轻冲洗，洗去多余的染料。
4.滴加Lugol氏碘液1~2min，紫色部分变黑为止。
5.水洗倾去Lugol氏碘液水洗。

6.脱色滴加95%以上的酒精，约30?60s(色素不溶出为止)。
7.水洗同5水洗。

8.复染滴加蕃红或沙黄染1~2min。
9.水洗同5水洗。

10.干燥自然干燥或用吸水纸吸干。

11.镜检用油镜观察，记录结果。