需-20℃冰箱冷冻保存的保存法

1、甘油保存法

甘油一生理盐水保存液的制备：取甘油(分析纯)8份加入生理盐水2份，充分混合后，经121.3℃ 30分钟灭菌备用。

将纯化后的菌株根据菌种不同分别划线接种于其最适宜生长的培养基上培养后，用接种针取典型菌落接种肉汤管37℃培养6-8小时(链球菌和奈瑟氏菌接种血清肉汤管，5-10%CO2环境下8-10小时培养，真菌直接用接种环取菌洗入肉汤管，不培养)。此为培养液。

将此培养液与保存液以5：2的比例混合分装于灭菌的微量离心管，置-20℃冰箱保存(链球菌、奈瑟氏菌置-80℃冰箱保存)。使用时需37℃水浴中快速解冻。

用上述方法保存一般菌株可存活3年以上，链球菌、奈瑟菌可存活12-15个月，且性状未发生变异。此方法采用幼龄肉汤培养物效果好，且适用于链球菌、奈瑟氏菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种。

2、低温保存法

菌种保存液的配制：K2HPO412.6g，柠檬酸钠0.98g，MgSO4·7H2O 0.18g，KH2PO4 3.6g，甘油88g加蒸馏水至1000ml，103.4KPa灭菌30分钟，4℃保存备用。

将细菌接种于肉汤培养基中，37℃ 培养16-18小时，或斜面培养物刮取于生理盐水中，然后加入等体积的菌种保存液，冻存于-70℃或-20℃冰箱中。

此方法也适合甲链、肺球、流感杆菌、百日咳杆菌、绿脓杆菌等耐受力低的细菌。-70℃保存10年以上，-20℃可保存2年以上。

3、细菌湿种牛奶冻存法

新鲜牛奶或15%奶粉煮沸，冷却脱脂，分装小试管，每管1ml，8磅15分钟灭菌备用。

将纯种菌接种于平板，37℃16小时培养，以接种环刮取菌苔2-3环于牛奶中混匀，试管用硅胶塞，冻存于普通冰箱冷冻室(-12℃-18℃)。使用时取出室温溶解，待部分溶解时即可取一环接种平板，并将试管再迅速冻存，这样可反复使用3-5次。此法一般菌株可存活48个月，少数如奈瑟氏菌、甲链、白喉等可存活14-30个月。

4、甘油原液保存法

将各待保存的菌种纯化后用接种环直接从平板上刮取，置于盛有0.5ml甘油原液的菌种瓶中，-20℃保存，可连续52个月存活良好。

此法尤其适合乙链、破伤风杆菌、产气荚膜梭菌、白色念珠菌等需特殊方法保存的菌种，是一种简便实用的有效保存方法。


需低温-30或-70℃冰箱保存

1、脱纤维羊血

无菌抽取羊颈静脉血后，沿瓶壁注入无菌的带玻璃的三角烧瓶中，同时立即同一方向振摇约8-10分钟，脱去纤维，然后分装加盖无菌小试管中约1.0-1.5ml。

将脑膜炎双球菌、淋球菌、甲乙型链球菌、肺炎双球菌分别接种于血平板培养基中，前两者置于5-10% CO2 烛缸内，经35℃16-18小时培养，后三者置37℃恒温箱培养24小时，然后无菌操作取一接种环菌苔移种于上述新鲜脱纤维羊血试管中，立即置-3O℃冰冻保存二年转种一次。用时室温自然冰融即可接种。

2、 纸片法

新华定性滤纸剪成4mm×4mm，1.5ml带盖离心管消毒灭菌备用，用消毒小钳子钳上滤纸片于平板上刮取待保种的纯菌落2-3个。放于离心管内塞盖再用封口胶布将盖边缘封好放于-30℃冰箱保存。保存12个月后取出菌种解冻后用无菌钳取一片放于肉汤管内37℃培养12小时后转种血平板，性状未变异。

3、 奶粉液菌种保存法

菌种保存液：脱脂奶粉10g，NaCL 10.5g，加双蒸水100ml，121℃ 5分钟高压灭菌后分装于1ml带盖无菌标本杯中(0.5ml)备用。

无菌操作用4mm×10mm 无菌滤纸条蘸取新鲜菌少许，放存含奶粉液保存杯中，盖好，封口胶封口，低温保存。3年存活率达99.2% 。

使用时将标本杯取出，不等全部融化，上层有少许融化即用接种环取一少许接种于血平板分离即可。


结论

菌种是细菌工作中所不可缺少而又具有传染性生物学因子。为了保证工作和安全，对菌种必须妥善保存和保管。保存菌种不仅要求不死，还要求其生物学性状、生理特性、抗原性等方面不发生变异，这是保存菌种的重要环节。延长菌种存活期应注意：首先，待保存菌种须选择生长期幼龄培养物，且制成浓菌液保存，以保证存活率。其次，高层半固体培基最好选择不含或含糖量低的培基，可减少或避免因代谢产物产生而造成的细菌死亡。最后，保存温度的高低可影响存活率，切忌反复冻融。

以上介绍的几种方法，取材简单，操作容易，已经反复实践证明保存时间长，变异小，适合中小型实验室使用。