第一法：大肠菌群 MPN计数法

一、检验程序

二、操作步骤

1、样品的稀释

①固体和半固体样品:称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内 ,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。

②液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 (瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。

③样品匀液的pH 应在6.5~7.5之间,必要时分别用1mol/LNaOH 或1mol/L HCl调节。

④用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲 液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。

⑤根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。

2、初发酵试验

每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤),36 ℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。

3、复发酵试验(证实试验)

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中，36 ℃±1 ℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。

4、可能数(MPN)的报告

根据确证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索 MPN 表,报告每g(mL)样品中大肠菌群的 MPN 值。

现行有效的16版&03版

第二法：平板计数法

一、检验程序：

1、样品的稀释

按MPN法中的稀释方法进行

2、平板计数

①选取2个~3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1mL。同时取1mL 生理盐水加入无菌平皿作空白对照。

②及时将15mL~20mL融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平 皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA 覆盖平板表 层。翻转平板,置于36 ℃±1 ℃培养18h~24h。

3、平板菌落数的选择

选取菌落数在15CFU~150CFU 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落 (如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm 或更大,最低稀释度平板低于15CFU 的记录具体菌落数。

4、证实试验

从 VRBA 平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于 BGLB肉汤管内,36℃±1℃培养24h~48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气, 即可报告为大肠菌群阳性

5、大肠菌群平板计数的报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每 g(mL)样品中大肠菌群数。例:10^-4样品稀释液1mL,在 VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:

100×6/10×10⁴/g(mL)=6.0×10⁵CFU/g(mL)。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀 释倍数计算。

备注:

6.0×10⁵CFU/g(mL)也 就是600000CFU/g(mL)这个作为公司统一的数据修约后的报告方式，若均无菌落生长则报告值为<10CFU/g(mL)

例:10^-2样品稀释液1mL，在VRBA平板上有90个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有10个阳性管,则该样品的大肠菌群数为: 90×10/10×10²/g(mL)=9000CFU/g(mL)