菌落计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法(Most-Probable-Number Method,简称MPN法),其中平皿法可分为倾注平皿法和涂布平皿法,常见的菌落总数操作方法见表1。
测试标准 |
适用范围 |
操作方法 |
GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》 |
食品 |
倾注平皿法/菌落总数测试片 |
FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3:2001《Aerobic Plate Count》 |
食品 |
倾注平皿法/螺旋板法 |
GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》 |
饲料 |
倾注平皿法 |
GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》 |
游泳池水 |
倾注平皿法 |
GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法 微生物指标》 |
饮用水/水源水 |
倾注平皿法/酶底物法 |
WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》 |
环境 |
六级筛孔撞击式微生物采样器 |
GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准 附录B2》 |
一次性卫生用品 |
倾注平皿法 |
《化妆品安全技术规范》2015版 |
化妆品 |
倾注平皿法 |
BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 |
化妆品 |
平皿法/膜过滤法 |
USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 |
药品 |
平皿法/薄膜过滤法/MPN法 |
BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 |
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EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 |
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ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查:微生物限度计数》 |
根据上表的适用范围和操作方法可得出,平皿法是使用范围最广。
根据测试标准适用范围和样品特性:
A.平皿法因可操作性性强,会更多用于污染度高的被检样品;
B.薄膜过滤法适用于测试量需求大且污染度一般的液体样品;
C.MPN法可用于微生物计数时精确度较差时,包括对于某些微生物污染度很小的样品。
故在日常测试中,可根据样品的污染度情况去选择更合适的菌落总数测试操作方法。
样品的取样量与其雷竞技百科 标准或测试方法去选择,对于官方标准未明确取样量的,亦可根据结果的代表性加大取样量。稀释缓冲液的选择则是要求样品在稀释缓冲液中能够充分混合,从而保证样品的均一性,故不同样品,会有不同的稀释液需求。日常工作中,常见的稀释缓冲液与要求见表2。
测试标准 |
样品量 |
稀释液 |
备注 |
GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》 |
25g/mL |
无菌生理盐水/磷酸盐缓冲液 |
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FDA- Bacteriological Analytical Manual Chapter 3:2001《Aerobic Plate Count》 |
50g/mL |
磷酸盐缓冲液/无菌水 |
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GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》 |
25g/10g |
0.85%生理盐水/磷酸盐缓冲液 |
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GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》 |
原液 |
无菌生理盐水 |
|
GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法 微生物指标》 |
原液 |
无菌生理盐水 |
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WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》 |
28.3L/min,(5-15)min |
不适用 |
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GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准 附录B2》 |
10±1g |
无菌生理盐水(200mL) |
不进行梯度稀释,做5平行 |
《化妆品安全技术规范》2015版 |
10g/mL |
无菌生理盐水 |
无法充分溶解稀释液中的样品可加吐温80和/或石蜡 |
BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 |
1:10(样品:加稀释液后) |
无菌生理盐水、磷酸盐缓冲液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液等 |
最终的取样量与稀释液,需通过样品方法学适用性验证方能使用。 |
USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS:MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 |
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BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 |
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EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 |
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ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查:微生物限度计数》 |
菌落总数的培养条件会因不同的样品类型或制定机构而有所差异,其差异包括培养基、培养温度和培养时间的选择。菌落总数常见的培养条件见表3。
测试标准 |
培养基 |
培养温度 |
培养时间 |
GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》 |
平板计数琼脂(PCA) |
36±1℃(水产品30±1℃) |
48±2h(水产品72±3h) |
FDA-Bacteriological Analytical Manual Chapter 3:2001《Aerobic Plate Count》 |
35±1℃(牛奶32±1℃) |
48±2h |
|
GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》 |
营养琼脂(NA) |
30±1℃ |
72±3h |
GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》 |
36±1℃ |
48h |
|
GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法 微生物指标》 |
36±1℃ |
48±2h |
|
WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》 |
35~37℃ |
48h |
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GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准 附录B2》 |
35±2℃ |
48h后 |
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《化妆品安全技术规范》2015版 |
卵磷脂、吐温80-营养琼脂 (LTNA) |
36±1℃ |
48±2h |
BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 |
胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA) |
32.5±2.5oC |
72±6h |
USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 |
3~5天 |
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BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 |
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EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 |
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ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查:微生物限度计数》 |
菌落总数在进行计数时,肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(CFU/cfu,Colony Forming Units)进行报告。在计数时,首先需明确计数范围是否符合要求,从而保证测试结果的准确性和可靠性,不同的测试方法在首选计数范围会有一定差异,以及显色剂在观察中的应用也有一定的要求。详情见表4。
测试标准 |
培养基中是否可加显色剂1 |
首选计数范围 |
最终结果报告 |
GB4789.2-2022 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》 |
是 |
30~300cfu |
100cfu以内报整数,超过100cfu两位有效数字,>300cfu的则报告TNTC2,采用“四舍五入”。 |
FDA-BacteriologicalAnalytical Manual Chapter 3:2001《Aerobic Plate Count》 |
否 |
25~250cfu |
<25cfu则报告<25或实际值,>250cfu则报告>250或TNTC2。 |
GB/T13093-2006 《饲料中细菌总数的测定》 |
否 |
30~300cfu |
100cfu以内报整数,超过100cfu两位有效数字,>300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
GB/T18204.9-2000 《游泳池水微生物检验方法 细菌总数测定》 |
否 |
30~300cfu |
100cfu以内报整数,超过100cfu两位有效数字,>300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
GB/T5750.12—2023《生化饮用水标准检验方法 微生物指标》 |
否 |
30~300cfu |
100cfu以内报整数,超过100cfu两位有效数字,>300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
WS 394-2012 《公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录D 集中空调送风中细菌总数检验方法》 |
否 |
无 |
报告cfu/m3 |
GB15979-2002 《一次性使用卫生用品卫生标准 附录B2》 |
否 |
无 |
全部无生长报<4cfu/g(mL),若生长,报100cfu以内报整数,超过100cfu两位有效数字。 |
《化妆品安全技术规范》2015版 |
是 |
30~300cfu |
100cfu以内报整数,超过100cfu两位有效数字,>300cfu的则报告TNTC2。采用“四舍五入”。 |
BS EN ISO 21149 (2017) 《Cosmetics- Microbiology -Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria》 |
否 |
平皿法:30~300cfu;薄膜过滤法:15~150cfu。 |
100cfu以内报整数,超过100cfu两位有效数字。 |
USP-NF 61 《MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: MICROBIAL ENUMERATION TESTS》 |
否 |
平皿法:不超过250cfu;薄膜过滤法:记录结果。 |
取两位有效数字报告 |
BP Appendix XVI B 《Microbiological Examination of Non-sterile Products》 |
|||
EP 9.0 edition, Chapter 2.6.12《Microbiological examination of non-sterile products: microbial enumeration tests》 |
|||
ChP1105 2020版《非无菌产品微生物限度检查:微生物限度计数》 |
否 |
平皿法:不超过300cfu;薄膜过滤法:不超过100cfu |
取两位有效数字报告 |
注: 1. 显色剂一般为TTC,TTC全称为0.5%氯化三苯四氮唑。加此显示剂后,多数菌落显示红色。 2. TNTC全称为多不可数,即Too Number To Count。 |
菌落总数的测定,不同样品有不同的特性,故在进行此方面卫生学测试时,结合行业需求,以及样品的生产工艺、消费对象、使用方式等需求,选择合适的测试操作流程,同时保证在报告结果时,亦需根据市场所选用的方法进行报告结果。
综合以上,卫生学的菌落测试在实验操作中虽然有差异,但总体的差异性不大,比如培养基都是非选择性生长培养基,培养温度基本在35℃左右,培养时间则温度越高,时间则可减少。故保证菌落总数测试结果的准确性与可靠性时,根据实际需求,通过调节测试方法的取样、稀释液、培养条件等来建立更符合本实验室的菌落总数测试方法。
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