生物薄膜Biofilm RNA提取试剂盒

生物薄膜在很多方面特性与土壤非常类似，如微生物群落混杂、细菌密度差异大、水分含量、化学组成和抑制因子。而富含有腐植酸抑制物、金属离子、盐和大量的多糖，这些方面也很像土壤，并且会影响核酸的提取。然而，生物薄膜和土壤的基本组成成分还是有很大的区别，所以提取DNA和RNA时，还需要另外加入一些处理手段。

下面介绍几个处理生物薄膜前需要考虑的东西。

样品收集:

采集生物薄膜样品可以很简单，刮下岩石上粘滑的一层、切下微生物垫（Microbial Mat）一小块，或连同生物薄膜和生长的基质一起采回来，通过涡旋、研磨均质、超声波或化学/酶处理，分离其中的生物薄膜物质。收集生长在岩石、淋浴莲蓬头、管道、牙齿上的生物薄膜相对比较麻烦点，通常采用超声波、研磨均质或刮取法分离微生物群落。化学和酶处理很少用，因为它们不能适用于所有类型的胞外混合物。

胞外聚合物EPS:

细菌分泌的胞外聚合物不但是结构上的需要，还是抵抗环境压力的利器，同时它也抵抗抗生素或裂解缓冲液的使用。越老越成熟的生物薄膜EPS含量越高，硬度也越大。越粘稠的生物薄膜含有更多的沉积物、盐和矿物沉淀。裂解条件很好的情况下，加样量不用太多。一个地点多采几个样，微环境的差异有可能影响微生物种群的结构。较薄的生物薄膜里头微生物相对较少，需要多加样。另外，若生长基质本身比较细腻，可以连同生物薄膜一起放进Bead Beating Tube中进行提取。

裂解:

保证充分的裂解是处理生物薄膜难的一个部分。微生物垫使用强力的珠磨研磨机可以取得很好的均质效果，而富含EPS的样品经过长时间珠磨研磨后，裂解物会变得非常粘稠。随着研磨时间增加，可转移出来用于下一个步骤的裂解物就大幅减少。终影响到核酸提取得率。而在涡旋仪上涡旋振荡则不会出现这种请款。使用PowerBiofilm? 裂解缓冲液处理富含EPS的样品，10min的普通涡旋振荡可以获得高速珠磨研磨机差不多的提取得率。

抑制因子Inhibitors:

就算裂解步骤再成功，也避免不了降解多糖、腐植酸及其它/无机成分的污染。其中一个去处降解多糖等物质的办法是在裂解完成后使用IRT技术（抑制因子去除技术）。根据裂解物的颜色和粘稠度（腐植酸等抑制因子水平的指标），IRT的步骤可以做修改。对于比较清亮的裂解物或已知EPS较少的样品（当然，也不那么粘稠），可以减少抑制因子去除溶液的使用量。相反，呈棕色富含大量腐植酸的样品需要更多的抑制因子去除溶液。我们给出了两种抑制因子去除溶液的使用量，因为大量使用来去除抑制因子的同时也会去除掉部分核酸。所以使用适当的溶液量去抑制因子，是获得得率化的关键。

为了化无抑制因子核酸的得率，需要平衡EPS含量与细菌密度。下面的列表会随着对生物薄膜的继续深入研究或遇到新类型有趣的样品而可能增加。

1）少加样。当使用2ml Bead Tubes小量提取时，加样量控制在0.05-0.2g。有些研究者通过自己实验室长期摸索优化，加样量有达到0.25-0.3g的。使用超过建议加样量常常会导致提不到核酸（见第三点）。建议加样量不是指导范围而是裂解溶液化学物的处理范围。过量加样会影响生物薄膜生长基质的去除和细胞裂解。

2）使用试剂盒提供研磨珠套管。PowerBiofilm的研磨珠套管是经过专门设计适应裂解溶液化学物工作的。它不是简单的研磨珠混搭。外容器Tube本身非常坚硬，可适用于普通的涡旋振荡和强力高速珠磨研磨机，不会中途破裂。请不要把研磨珠转移到其它Tube管中使用。有些人未曾用过不透明的研磨珠套管，不过把离心后碎片等会沉淀下来，转移上清不会很困难。去尝试，如果有困难请随时联系我们。

3）不要超时研磨。使用你实验室常规研磨均质设备和标准设置不一定，有可能过分研磨。根据我们的经验，加长样品研磨时间或更大的研磨强度并不能提高得率。随着研磨时间的延长和强度的增加，多糖和其它/无机成分容易形成粘稠的裂解物。绝大多数这类物质不可溶，且会吸附核酸，导致核酸丢失。如果研磨完毕可转移的裂解物少于400μl，那么就是研磨太过了。高速研磨30s比较合适。

4）使用适量洗脱液。这条适用于使用二氧化硅滤膜过滤柱进行洗脱。的洗脱液体积是100μl。这个量可让核酸充分洗脱下来。均匀加到滤膜上的话，50μl小量也还能保证核酸洗脱效率，不过100μl能获得充分洗脱。使用小于50μl会严重影响核酸得率。请记住，稀释的核酸可通过浓缩缩小体积。

5）不要以为所有生物薄膜（biofilm）和生物垫（biomats）都差不多。有些生物薄膜杂质很多微生物很少，得率远没有想象中的那么高。若洗脱后分光光度计测不出来DNA或RNA，加样量没有超出建议值，也没有研磨太过，也许只是核酸浓度非常低。你仍然有可能通过PCR检测得到（见第六点）。若对你的生物薄膜样品不太了解，与预期得率差异很大，请联系我们，或者可以给出更多优化建议。关于一些生物薄膜和生物垫的常规得率，点击这里（biofilm_apnote）。

6）凝胶电泳和PCR共同评估核酸。使用紫外光检测得率，许多因素会影响读数的准确性。腐植酸和污染的RNA可明显推高A260。DNA碎片比完整DNA片段读数要高。凝胶电泳可更好检验分光光度计的结果。因为PowerBiofilm使用了IRT技术（抑制因子去除技术），获得的核酸非常纯净，所以若读数较低，也要比未经有效纯化DNA和RNA得到的结果更准确。如果凝胶电泳看不到条带，尝试PCR扩增。使用了IRT技术的PowerBiofilm Kit能保证扩增的成功率，这点明显区别于其它提取方法。

小结：

希望上述的几条建议能帮助正在努力奋斗提取此珍贵样品生物学信息的你。花费大量时间和长途跋涉采样辛苦劳累，我们懂！希望你们试验能成功。后面会发布更多技术要领。也欢迎你与我们分享处理生物薄膜的心得和技巧。