[牛病诊断]牛支原体抗体检测

 BioVet牛支原体ELISA抗体检测试剂盒说明书(TRM-502)

该试剂盒是根据用酶联免疫原理用来检测牛血清中抗支原体抗体水平。

流行病学研究发现，牛支原体能引起奶牛乳房炎和犊牛肺炎。同时，牛支原体也能导致母牛流产。对牛支原体的诊断，血清学方法是一种很有价值的诊断方法，因为牛支原体感染的免疫应答是早期的，重要而且稳定的。

实验原理：将牛的血清样品被稀释并加入到事先包被好了的牛支原体抗原的微孔板上，经孵育，样品中的抗牛支原体抗体和包被好的支原体抗原发生结合；经几遍洗涤并去除未发生反应的物质，加入牛的酶标记抗体，经孵育，牛的酶标记抗体和样品中的抗体结合，形成抗原抗体和酶复合物；经第二次洗涤，去除未反应的酶标记物抗体，加入底物显色剂显色，加入终止液终止显色，读取光密度值，颜色的强弱表明检测样品中牛支原体抗体的含量。

材料：

所需材料但不提供

纯净水

单道和多道的移液器

一次性的微量塑料滴头

洗板机

样品稀释管（96孔未包被抗原的干净稀释板）

能测定96孔ELISA板的酶标仪

稀释的容器或其他的稀释物品

试剂盒中提供的试剂

组份                                                  数量

96孔包被牛支原体抗原的微孔酶标板                       1

即用的阳性对照                                         3ml

即用的阴性对照                                         3ml

即用的酶标记底物                                       12ml

10倍浓缩的洗涤液                                       75ml

即用的底物显色液                                       15ml

即用的终止液                                             7.5ml

当洗涤液在4±2℃放置有晶体析出，不会影响本产品的效果；如要使用本品，需先将洗涤液回温至晶体溶解再使用。

注意事项：

本产品只适用兽医体外检测；

本检测试剂盒所用过的材料都看做有感染性，因此，用完后的废弃物都必须消毒灭菌处理后方可遗弃；

试剂盒包装上显示过期的试剂不要使用；

不同的试剂不要混淆；

只有在严格操作步骤情况下操作才能保证检测的敏感性和特异性；

不要将本试剂盒中的试剂在长时间暴露在阳光和强氧化剂环境中；

底物溶液经常在塑料容器中保存，可能会对眼睛和皮肤有刺激性；

所有的试剂必须在4±2℃保存，使用前必须回温至室温。

操作：

A、 洗涤液的准备：将浓缩的洗涤液摇匀(无晶体出现)，用纯净水作10倍稀释（即1份浓缩洗涤液+9倍纯净水）。然后将1倍稀释好的洗涤液4±2℃保存备用。

B、样品和对照的准备：强烈建议样品和对照设立重复（分别设立两个以上阴阳性对照，样品做双份检测）

样品用配制好的1倍洗涤液作1：20倍稀释，（25ul血清样品+475ul 1倍的洗涤液）。确定每次加入新样品时更换吸头。确定每个样品在加入检测孔前混合均匀。

C、 检测步骤

在使用试剂盒之前，把试剂盒中每份试剂回温至室温，并用手摇匀。

1、 加样前，事先画一个表，表明样品和对照的分布情况；

2、 加入200ul阳性对照于A1和A2；

3、 加入200ul阴性对照于B1和B2；

4、 加入200ul稀释好的样品到C1/C2，D1/D2，…

5、 在23 ± 2°C环境下孵育30分钟；

6、 用300ul 1倍稀释的洗涤液把酶标板洗涤3遍，每次洗涤后去除孔内的所有水滴，一遍在吸水纸上拍干；

7、 加入即用的酶标记物，每孔100ul；

8、 在23 ± 2°C环境下孵育30分钟；

9、 重复步骤6；

10、              加入即用的底物显色剂，每孔100ul；

11、              在23 ± 2°C环境下避光孵育10分钟；

12、              加入即用的终止液，每孔50ul；

13、              用450nm的单波长测定光密度值（OD值）（OD值的测定务必在加入终止液15分钟内完成）。

14、              计算结果

阴阳性临界值和结果分析：计算每个样品和对照的平均值。阳性临界值即阳性对照平均值乘以0.3得到。

阳性临界值=0.3*MODp

实验结果必须符合下列标准才能有效，并对实验结果进行分析：

阴性对照平均值必须小于阳性对照平均值；

阳性对照平均值必须大于或等于1.0.

结果分析：

如果样品的OD低于阳性临界值，则认为样品为阴性；

如果样品的OD值大于或等于阳性临界值，则认为样品为阳性。

按照以下规则对检测血清进行分类，对血清中抗体的含量更加明确。

OD值间隔段	结果判定
样品OD值＜阳性临界值	阴性
阳性临界值＜样品OD值＜1.75*阳性临界值	+
1.75*阳性临界值＜样品OD值＜2.3*阳性临界值	++
2.3*阳性临界值＜样品OD值＜3*阳性临界值	+++
样品OD值＞3*阳性临界值	++++