saCas9体外酶切试剂盒

产品简介：

本产品主要用于CRISPR/saCas9系统体外酶切实验、CRISPR靶点筛选等实验，可以在体外切割PCR产物、质粒等双链DNA。

试剂盒中提供了saCas9体外酶切所需试剂，包括saCas9蛋白，反应缓冲液，以及对照sgRNA和底物DNA。使用该试剂盒可以快速开展saCas9体外酶切实验。

产品规格：

	货号	PC1600-0（20次）	PC1600-1（20次）	PC1600-5（100次）
	saCas9蛋白	100U	100U	500U
	10 x saCas9 Buffer	150ul	150ul	600ul
	阳性对照sgRNA	-	25ul	125ul
	阳性对照DNA	-	50ul	250ul
	Cleaner试剂	100ul	100ul	500ul

活性定义：37℃，30分钟切割1ug 1kB DNA双链定义为1个活性单位。
储存条件：-20℃冻存

实验步骤：
1、saCas9切割反应：
1.需准备：底物DNA，浓度大于100ng/ul；sgRNA，浓度大于200ng/ul。
！务必采用无RNA酶的耗材进行实验，注意防止RNA酶污染。

按照下表配制saCas9体外切割反应缓冲液，请按表中顺序加入：

saCas9蛋白	5μl
sgRNA	1 ug（aul）
底物DNA	1~2 ug（bul）
10×saCas9 Buffer	Xμl*
*X=0.1×(5+a+b)

阳性对照反应：

saCas9蛋白	5ul
阳性对照sgRNA	5ul
阳性对照DNA	10ul
10 x saCas9 Buffer	2 ul

1.2吹吸混合均匀。

反应程序：
37℃ 30min
85℃ 10min

2、产物检测：
快速检测：

1. 在反应体系中加入5ul Cleaner，混匀。55℃孵育5min。（本步骤及以后的步骤不必使用无RNA酶耗材操作）

2. 取 5ul 进行凝胶电泳检测（不必加入DNALoadingBuffer）。

乙醇沉淀法检测：
本方案耗时约30min，电泳条带更清晰。
本步骤及以后的步骤不必使用无RNA酶耗材操作

1. 加水将反应产物补足50ul。

2. 加入50ul酚氯仿异戊醇试剂。震荡混匀。

3. 室温12000rpm离心5min。

4. 取上清至新的1.5ml离心管，加入5 ul 3M NaAc pH5.2，混匀。

5. 加入110ul无水乙醇，混匀。

6. 4℃ 12000rpm离心10min。

7. 去除上清，加入500ul 70%乙醇，震荡混匀。

8. 4℃ 12000rpm离心5min。

9. 去除上清，空离心2min，12000rpm，用移液器尽量吸去残留液体，开口室温放置2-5min。

10. 加入10-15ul蒸馏水，震荡溶解沉淀。取3-5ul 进行凝胶电泳检测。

2、阳性对照电泳结果：
阳性对照DNA为1000bp 双链DNA。含有单一靶点。切割产物409bp、591bp。

产品保存和使用注意事项：

1. saCas9蛋白使用过程中尽量保持低温。

2. 阳性对照sgRNA需用无RNA酶枪头取用，以免RNase污染导致降解。

3. 若切割效果不理想，可提高sgRNA的含量。

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