spCas9 SpRY突变体体外酶切试剂盒

产品简介：

本产品主要用于spCas9 SpRY突变体体外酶切实验和靶点筛选等实验。SpCas9突变体SpRY识别的PAM序列为NRN（R为A/G）以及部分NYN（Y为C/T），与型spCas9的PAM序列NGG相比，极大的解除了PAM的限制，可供选择的靶点更多。

本试剂盒可以在体外切割PCR产物、质粒等双链DNA。试剂盒中提供了SpCas9突变体SpRY蛋白，反应缓冲液，以及对照sgRNA和底物DNA。使用该试剂盒可以快速开展体外酶切实验和筛选适合该突变体的靶点。

产品规格：

活性定义：37℃，30分钟切割1μg 1kB DNA双链定义为1个活性单位。
储存条件：-20℃冻存

实验步骤：
1、切割反应：
1.1需准备：底物DNA，浓度大于100ng/ul；sgRNA，浓度大于200ng/ul。
！务必采用无RNA酶的耗材进行实验，注意防止RNA酶污染。
按照下表配制SpRY体外切割反应缓冲液，请按表中顺序加入：

SpRY蛋白	5 μl
sgRNA	1μg（aμl）
底物DNA	1~2μg（bμl）
10×Cas9Buffer	Xμl*
*X=0.1×(5+a+b)

阳性对照反应：

SpRY蛋白	5μl
阳性对照sgRNA	5μl
阳性对照DNA	10μl
10×Cas9Buffer	2 μl

1.2吹吸混合均匀。

反应程序：
37℃ 30min
85℃ 10min

2、产物检测：
快速检测：

1. 在反应体系中加入5μlCleaner，混匀。55℃孵育5min。（本步骤及以后的步骤不必使用无RNA酶耗材操作）
2. 取5μl进行凝胶电泳检测（不必加入DNALoadingBuffer）。

乙醇沉淀法检测：
本方案耗时约30min，电泳条带更清晰。
本步骤及以后的步骤不必使用无RNA酶耗材操作

1. 加水将反应产物补足50μl。
2. 加入50μl酚氯仿异戊醇试剂。震荡混匀。
3. 室温12000rpm离心5min。
4. 取上清至新的1.5ml离心管，加入5 μl 3M NaAc pH5.2，混匀。
5. 加入110μl无水乙醇，混匀。
6. 4℃ 12000rpm离心10min。
7. 去除上清，加入500μl 70%乙醇，震荡混匀。
8. 4℃ 12000rpm离心5min。
9. 去除上清，空离心2min，12000rpm，用移液器尽量吸去残留液体，开口室温放置2-5min。
10. 加入10-15μl蒸馏水，震荡溶解沉淀。

取3-5μl进行凝胶电泳检测。
2、阳性对照电泳结果：
阳性对照DNA为760bp 双链DNA。含有单一靶点。切割产物为两条带分别是505bp左右和255bp左右。

M：DL2000 DNA marker
1：SpRY蛋白不加gRNA切割30min
2：SpRY蛋白加gRNA1切割30min
3：SpRY蛋白加gRNA2切割30min
4：SpRY蛋白加gRNA3切割30min

产品保存和使用注意事项：

1. SpRY蛋白使用过程中尽量保持低温。
2. 阳性对照sgRNA需用无RNA酶枪头取用，以免RNase污染导致降解。
3. 若切割效果不理想，可提高sgRNA的含量。

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