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概述
适用范围
适用于奶粉中添加维生素B12（VB12）含量的定量分析。该试剂盒可进行96次测定。
实验原理
VB12检测试剂盒采用微生物方法定量检测奶粉中添加VB12的含量。微生物检测体系与规范保持一致。德氏乳杆菌的生长离不开VB12，其生长强度与样品中VB12的含量有关，将已加入德氏乳杆菌的VB12检测培养基、样品或标品加入到微孔中，37°C避光孵育，德氏乳杆菌开始生长直至VB12被完全消耗，44-48小时完成孵育。采用酶标仪读取610-630nm或540-550nm下样品的浑浊度，将样品浊度与标准曲线对比即可得到样品中VB12的含量。
检测步骤
1、标准品配制
1） 打开无菌水瓶盖：沿着箭头方向向上推开蓝色盖帽，逆时 针拉开铝塑盖，取下整个盖帽，然后打开瓶塞，将瓶塞内 侧朝上放置。
2） 打开生物素标准品瓶盖，取 x mL 无菌水加入标准品瓶中 （x 值见标准品瓶包装标签），盖上瓶盖，振荡使标准品 充分溶解，即为标准品工作液。
3） 取 6 个无菌管（1.5 或 2.0mL），将标准品工作液按照下 表进行稀释。标准品必须现配现用。 标准曲线 μg/100g 无菌水 （μL） 标准品工作 液（μL） 总体积 （μL） 空白：0 500 + 0 = 500 标准品 1:0.08 480 + 20 = 500 标准品 2:0.24 440 + 60 = 500 标准品 3:0.4 400 + 100 = 500 标准品 4:0.56 360 + 140 = 500 标准品 5:0.72 320 + 180 = 500 *标注曲线中已经包含样品 40 倍的提取稀释倍数。
2、检测培养基的配制
1） 打开培养基瓶盖，用无菌镊子取出干燥剂并丢弃。
2） 将 10mL 无菌水（必须取自试剂盒中）加入生物素检测培 养基瓶中，盖紧瓶盖，振荡混匀。
3） 保证瓶盖密闭的前体下，95℃水浴加热 5min，然后快速 冷却至室温（低于 30℃）。
4） 使用 0.22μm 无菌滤膜过滤全部培养基，用 15mL 无菌离 心管收集全部滤液。
5） 取出冻干菌株，沿着箭头方向向上推开蓝色盖帽，逆时 针拉开铝塑盖，取下整个盖帽，轻轻打开瓶塞，将瓶塞 内侧朝上放置；向菌株瓶内加入 1mL 无菌水（必须取自 试剂盒中），用移液枪吹打混匀，取其中的 Y mL（Y 值 见菌株包装瓶标签）加入过滤后的培养基中，振荡混匀， 即为检测菌液（检测菌液须现配现用）。 注：如果培养基在处理的过程中出现较大体积的损失时， 加入的冻干菌株体积需要做相应比例的调整。为杜绝实验室污 染，菌株瓶中剩余的菌再用瓶塞密封，及时清理出实验室或者 高压灭菌处理；制备的检测菌液如有剩余，也需要及时清理出 实验室或者高压灭菌处理。
3、检测步骤
注：加入微孔板中的样品必须为无菌样品（使用试剂盒中 提供的无菌水进行稀释）。
1） 取出所需数量的微孔条置于微孔架上，将剩余微孔板条 放回铝箔袋中密封，2-8℃储存。
2） 依次将 140μL 标准品或样品、140μL 检测菌液加入微孔 中（用标准品或样品溶液润洗枪头），然后用粘胶薄膜盖 好微孔条（揭开粘胶薄膜的保护层，用手或压舌板将粘胶 薄膜压平，使其充分封闭微孔板条）。 注:保证粘胶薄膜和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘 部分。
3） 在 37℃培养箱中避光孵育 44-48 小时。
4） 轻轻来回颠倒混匀微孔板，使菌液充分混匀，然后用一 只手将微孔条固定于微孔架上，另一只手自右上方沿对 角揭开粘胶薄膜，静置 2min 待气泡全部消去（较难消去 的小气泡用移液枪吸出）后用酶标仪在 610-630nm 或540-550nm 下测量浑浊度。 注：孵育完成后，微孔板可在冰箱中保存的长时间为 48h，然后用酶标仪读数。
注意事项
1） 试剂盒应在 2-8℃储存，产品过期后请勿使用。
2） 加入微孔板中的样品必须无菌，样品稀释时必须使用试 剂盒中提供的无菌水。样品提取后必须在无菌的环境中进 行操作，且实验中需要的其他耗材也必须无菌。
3） 检测培养基会刺激眼睛、皮肤和黏膜，应小心使用。
4） 试验完成后必须按照规章对微孔条进行处理（如高压灭 菌）。
5） 为确定样品中是否存在抑制因素，应进行回收率测定。 提取之前，向样品中加入已知浓度的生物素溶液，回收率 应约为 80-120%。当回收率较低时，表明存在抑制因素， 应增加样品稀释倍数以消除抑制因素的影响。
适用范围
适用于奶粉中添加维生素B12（VB12）含量的定量分析。该试剂盒可进行96次测定。
实验原理
VB12检测试剂盒采用微生物方法定量检测奶粉中添加VB12的含量。微生物检测体系与规范保持一致。德氏乳杆菌的生长离不开VB12，其生长强度与样品中VB12的含量有关，将已加入德氏乳杆菌的VB12检测培养基、样品或标品加入到微孔中，37°C避光孵育，德氏乳杆菌开始生长直至VB12被完全消耗，44-48小时完成孵育。采用酶标仪读取610-630nm或540-550nm下样品的浑浊度，将样品浊度与标准曲线对比即可得到样品中VB12的含量。
检测步骤
1、标准品配制
1） 打开无菌水瓶盖：沿着箭头方向向上推开蓝色盖帽，逆时 针拉开铝塑盖，取下整个盖帽，然后打开瓶塞，将瓶塞内 侧朝上放置。
2） 打开生物素标准品瓶盖，取 x mL 无菌水加入标准品瓶中 （x 值见标准品瓶包装标签），盖上瓶盖，振荡使标准品 充分溶解，即为标准品工作液。
3） 取 6 个无菌管（1.5 或 2.0mL），将标准品工作液按照下 表进行稀释。标准品必须现配现用。 标准曲线 μg/100g 无菌水 （μL） 标准品工作 液（μL） 总体积 （μL） 空白：0 500 + 0 = 500 标准品 1:0.08 480 + 20 = 500 标准品 2:0.24 440 + 60 = 500 标准品 3:0.4 400 + 100 = 500 标准品 4:0.56 360 + 140 = 500 标准品 5:0.72 320 + 180 = 500 *标注曲线中已经包含样品 40 倍的提取稀释倍数。
2、检测培养基的配制
1） 打开培养基瓶盖，用无菌镊子取出干燥剂并丢弃。
2） 将 10mL 无菌水（必须取自试剂盒中）加入生物素检测培 养基瓶中，盖紧瓶盖，振荡混匀。
3） 保证瓶盖密闭的前体下，95℃水浴加热 5min，然后快速 冷却至室温（低于 30℃）。
4） 使用 0.22μm 无菌滤膜过滤全部培养基，用 15mL 无菌离 心管收集全部滤液。
5） 取出冻干菌株，沿着箭头方向向上推开蓝色盖帽，逆时 针拉开铝塑盖，取下整个盖帽，轻轻打开瓶塞，将瓶塞 内侧朝上放置；向菌株瓶内加入 1mL 无菌水（必须取自 试剂盒中），用移液枪吹打混匀，取其中的 Y mL（Y 值 见菌株包装瓶标签）加入过滤后的培养基中，振荡混匀， 即为检测菌液（检测菌液须现配现用）。 注：如果培养基在处理的过程中出现较大体积的损失时， 加入的冻干菌株体积需要做相应比例的调整。为杜绝实验室污 染，菌株瓶中剩余的菌再用瓶塞密封，及时清理出实验室或者 高压灭菌处理；制备的检测菌液如有剩余，也需要及时清理出 实验室或者高压灭菌处理。
3、检测步骤
注：加入微孔板中的样品必须为无菌样品（使用试剂盒中 提供的无菌水进行稀释）。
1） 取出所需数量的微孔条置于微孔架上，将剩余微孔板条 放回铝箔袋中密封，2-8℃储存。
2） 依次将 140μL 标准品或样品、140μL 检测菌液加入微孔 中（用标准品或样品溶液润洗枪头），然后用粘胶薄膜盖 好微孔条（揭开粘胶薄膜的保护层，用手或压舌板将粘胶 薄膜压平，使其充分封闭微孔板条）。 注:保证粘胶薄膜和微孔的封闭性，特别注意微孔的边缘 部分。
3） 在 37℃培养箱中避光孵育 44-48 小时。
4） 轻轻来回颠倒混匀微孔板，使菌液充分混匀，然后用一 只手将微孔条固定于微孔架上，另一只手自右上方沿对 角揭开粘胶薄膜，静置 2min 待气泡全部消去（较难消去 的小气泡用移液枪吸出）后用酶标仪在 610-630nm 或540-550nm 下测量浑浊度。 注：孵育完成后，微孔板可在冰箱中保存的长时间为 48h，然后用酶标仪读数。
注意事项
1） 试剂盒应在 2-8℃储存，产品过期后请勿使用。
2） 加入微孔板中的样品必须无菌，样品稀释时必须使用试 剂盒中提供的无菌水。样品提取后必须在无菌的环境中进 行操作，且实验中需要的其他耗材也必须无菌。
3） 检测培养基会刺激眼睛、皮肤和黏膜，应小心使用。
4） 试验完成后必须按照规章对微孔条进行处理（如高压灭 菌）。
5） 为确定样品中是否存在抑制因素，应进行回收率测定。 提取之前，向样品中加入已知浓度的生物素溶液，回收率 应约为 80-120%。当回收率较低时，表明存在抑制因素， 应增加样品稀释倍数以消除抑制因素的影响。
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