微量法
注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义:
土壤脱氢酶(Soil dehydrogenase, sDHA)的活性可以反映土壤体系内活性微生物量以及其对物的降解活性,可以作为土壤微生物的降解性能指标。
测定原理:
氢受体2, 3, 5 -氯化三苯基四氮唑(2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride, TTC)在细胞呼吸过程中接受氢以后,被还原为三苯基甲鐟(Triphenyl Formazone, TF),TF呈现红色,在波长485nm处有吸收峰,采用分光光度法于485nm测定其吸光值,即得土壤脱氢酶活性。
自备实验仪器及用品:
筛子、天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、冰、蒸馏水、丙酮(不允许快递,请用户自备)。
试剂的组成和配制:
试剂一:粉剂×1瓶,使用前加5mL水溶解,4℃避光保存(尽量现配现用)。
试剂二:液体20mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:丙酮,自备。
样品处理:
1.土壤样品: 准确称取过40目筛的新鲜土壤样品约0.1g(以保证TTC与土壤颗粒充分接触)。
2.污泥样品:污泥用蒸馏水洗涤,10000g,25℃,离心10min,弃上清,反复3-4次。
测定步骤和操作表:
1、分光光度计/酶标仪预热0min,调节波长至485nm。
2、操作表
对照管
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测定管
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样品(g)
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0.05
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0.05
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试剂一(mL)
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0.1
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试剂二(mL)
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0.2
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0.1
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置于EP管中,充分混匀,37℃,暗培养6h,取出后立即冰浴5min
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试剂三(mL)
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0.1
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0.1
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反复震荡数次,37℃保温10min,10000g,4℃,离心5min,取200μL上清于微量石英比色
皿/96孔板,对照管调零,测定A 485。
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