英文名称:Toneker Fast-Fusion Cloning Kit
产品规格:
产品编号
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产品规格
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产品价格
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TK01143
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10次/盒
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¥400
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TK01145
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50次/盒
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¥900
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产品组成:
1、Fast-Fusion Enzyme
2、10× Fast-Fusion Buffer
产品简介:
Toneclone无缝克隆试剂盒基于DNA序列同源性进行片段重组,可将插入片段PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。将载体在克隆位点进行线性化,并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列,使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp~21 bp)。这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合后,在Fast-Fusion Enzyme的催化下,最快仅需反应5 min,即可进行转化,完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。
产品特点:
1、操作简便:无需考虑酶切点限制;
2、快速重组:15min实现载体和片段的快速重组;
3、效率更高:重组效率为传统酶切连接技术的5-10倍,无载体自连现象,阳性克隆可达90%以上。
产品应用:
1、PCR产物克隆进载体
2、基因转移
3、在插入片段前后插入adaptor、linker和标签
4、高通量克隆
实验方案
B.制备线性化载体
环形载体需要经过线性化处理,使载体待重组区域暴露出来,以供与插入片段进行重组拼接。线性化的方法可以通过限制性内切酶酶切或PCR方法实现。若采用酶切进行线性化处理,推荐进行琼脂糖凝胶电泳检测,并切胶回收,以尽量避免为切割载体在转化后造成假阳性结果。若PCR扩增得到线性化载体,推荐使用高保真聚合酶进行扩增,减少PCR体系中的模板用量以减少初始质粒造成的假阳性,并在PCR结束后对产物进行切胶回收或使用DpnI酶消化残余质粒模板。
C.插入片段的PCR引物设计
为了实现同源重组,插入片段扩增产物5’和3’末端需要带有和线性化克隆载体两个末端对应的完全一致的序列(15?21bp)。下图以pUC19作为克隆载体为例,设计引物:
Forward Primer→
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15 bp tract (F)BamHI Gene-specific Primer
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5’-CAG GTC GAC TCT AGA GGATCCXXX XXX…-3’
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Vecor pUC19
Clone site
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5’-TGC CTG CAG GTC GAC TCT AGA G
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AATTC ACT GGC CGT CGT TTT ACA ACG-3’
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3’-ACG GAC GTC CAG CTG AGA TCT CCTAG
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G TGA CCG GCA GCA AAA TGT TGC-5’
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3’-…XXX XXXCTTAAG TGA CCG GCA GCA AAA-5’
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Gene-specific PrimerEcoRI 15 bp tract (R)
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←Reverse Primer
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D.插入片段的PCR扩增
插入片段可选用任何DNA聚合酶进行扩增,TaqDNA聚合酶或其他具有校正活力的高保真酶都可以。若用TaqDNA聚合酶,产物末端的A尾在重组过程中将会被去除,不会因此产生单碱基插入突变。推荐使用高保真酶进行扩增,以减少在插入片段中引入突变。请在PCR完成后,进行琼脂糖凝胶电泳,确认获得单一条带的DNA片段。可切胶回收以除去模板、引物、引物二聚体。可通过与已知的DNA分子量marker比较,确定得到的DNA量。
E.重组反应体系的建立以及反应条件
在冰水浴中,配制如下反应体系,将缓冲、水、线性化载体、插入片段加入PCR管中,轻弹混匀,加入酶。
组成成分
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用量
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10× Fast-Fusion Buffer
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1 μl
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线性化载体
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20?100 ng
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插入片段
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10?100 ng
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ddH2O
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补加至10 μl
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Fast-Fusion Enzyme
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1 μl*
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最适线性化克隆载体与插入片段摩尔比为1:2,可由下列公式粗略计算获得:
?线性化载体= [0.01 ×线性化载体长度(bp)] ng
?插入片段= [0.01 ×插入片段长度(bp)] ng
例如将长度500 bp的插入片段克隆到长度2.7 kb的pUC19中,克隆载体的最适使用量为:0.01×2700=27 ng,插入片段的最适使用量为:0.02×500=10 ng。
注意:1.当插入片段大于克隆载体时,两者计算用量公式应互换。
2.线性化载体用量应在20?100 ng之间,插入片段扩增产物用量应在10?100 ng之间。当使用上述公式计算DNA用量超出这个范围是,请直接选择/使用量即可。例如插入片段200 bp,量计算值为4 ng,实际反应体系中应加入10 ng。
反应体系配制完成后,轻弹混匀,并通过短暂离心使其沉到管底,立即放入已预热的PCR仪或平衡至所需温度的水浴中。按下表中方案选其一进行。推荐在PCR仪中进行反应,60°C,15 min。(若选择在37°C水浴反应,请在10 μl反应中加入2μlFast-Fusion Enzyme。)反应结束后应立即将反应管置于冰水浴中冷却10 min,然后直接转化。也可选择?20°C储存,待需要时,冰上解冻并转化。
PCR热循环仪
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水浴
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70°C, 5 min
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60°C, 15 min
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37°C, 15 min
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4°C, ∞
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4°C, ∞
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冰水浴
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F.转化
推荐使用转化效率≥108cfu/μg的感受态细胞,按照对应的说明书操作。若转化效率低于108cfu/μg,可在凃布前将培养的菌液在6000 rpm离心5 min,沉菌用100μl培养基重悬后,全部涂于对应抗性的平板上。过夜培养后,形成数百个单克隆,可根据需要选择PCR或酶切鉴定是否为阳性。
G.常见问题与解决方案
问题
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可能的原因
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解决方案
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平板上无克隆或克隆数目很少
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引物序列不正确
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l确认引物序列含有15 bp与载体插入区域完全一致的同源序列。
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PCR产物不纯
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l优化PCR扩增反应以得到单一PCR产物。
l换一种纯化方法,纯化您的PCR产物。
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反应体系中DNA浓度太低
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l在重组反应中,加入推荐的DNA量。
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不纯的载体或插入片段抑制重组反应
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l推荐采用胶回收或离心柱法纯化DNA后进行重组反应。
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转化过程中加入重组反应液过多
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l重组反应液的转化体积不应超过转化细胞体积的1/10。
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感受态细胞转化效率低
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l更换新鲜、高效的感受态细胞。
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培养基中加入错误或过多抗生素
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l在转化平板中加入正确、适量的抗生素。
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假阳性克隆数目多
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克隆载体线性化不完全
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l重新酶切您的载体,增加酶切时间,并胶回收纯化。
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PCR使用的模板质粒抗性与所需克隆载体抗性相同造成的污染
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l可在PCR反应之前先将模板质粒线性化。
lPCR产物用DpnI处理,消化模板质粒,然后再纯化。
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转化用平板放置时间过长导致抗性失效
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l确认平板新鲜配置,并含有正确、适量的抗生素。
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克隆含有不正确的插入片段
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PCR产物混有非特异性片段
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l优化PCR扩增体系,提高特异性或胶回收纯化目的片段。
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