NCM460正常结肠上皮细胞和培养基_动物细胞培养基_培养基_仪器试剂_

NCM460正常结肠上皮细胞和培养基

【细胞货号】 C0972

"选择正确的培养基：不同的细胞可能培养基不同，甚至不同的文献可能对相同的细胞培养基成分也是可能不同的。如我当时培养神经干细胞，有文献就选用neurobase培养基，而我的实验目的主要是做和氧化方面的，而这种培养基中含有剂成分，此时，我就不得不选择另外一种不含剂的培养基。

瓶装血清一定要逐步解冻: 4℃冰箱全溶后再分装，在溶解过程中须规则摇晃均匀小心勿造成气泡，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃ 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

热灭活是指56℃，30分钟加热已完全解冻之血清。水浴锅升到56℃后，将血清放入，待温度升高到56℃后计时，一般5分钟左右规则摇晃均匀一次。此热处理之目的是使血清中之补体成份去活化。除非必须，一般不要作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。注意更换新血清包括不同批次对细胞的影响。【细胞缩写】" NCM460细胞

【细胞名称】 NCM460(正常结肠上皮细胞)

【背景资料】见细胞说明书

【细胞来源】细胞主要来源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少数国内外大学建系

【代次】 P4

【规格】复苏T25培养瓶(一瓶)或冻存1ml冻存管（两支）

"细胞冻存及复苏基本知识普及：

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。NCM460正常结肠上皮细胞和培养基利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。

除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%.15%的甘油或二甲基亚砜DMSO，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。

采用""慢冻快融""的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内-196℃。【细胞数】" 1*10（6）

【生物安全级别】 1

【生物体】人

【组织来源】结肠

【细胞形态】上皮细胞

【细胞特性】贴壁

【细胞活力】 95％（Viability by Trypan Blue Exclusion）

【细胞检测】细胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌

"细胞常规培养传代流程请严格遵照无菌操作

1、吸出原培养瓶中的培养基，PBS缓冲液润洗细胞两次，加2-3ml 0.25%胰酶进行消化细胞注意把握消化时间，通常控制在1-2min

2、镜下观察消化情况，在细胞边缘缩小，贴壁松动时不建议消化到细胞漂浮去掉胰酶，加6-8ml完全培养基，轻轻吹打细胞层，尽量把细胞层吹落，吹散

3、取部分细胞悬液转移到新的培养皿/瓶中，添加适当的完全培养基，把细胞悬液打匀，于培养箱中培养

4、注意培养基PH值变化情况，定期换液每周2-3次，待细胞密度达到80%以后重复1项操作或者冻存

特别注意：如使用公共实验室或者初次接触细胞培养，建议添加双抗培养

1、收到细胞后请尽快更换为含15%血清的新鲜培养基，如因特殊情况需要继续使用原瓶，请在原瓶培养基中额外添加10%的血清，原瓶培养基的继续使用时间最长不宜超过72小时

2、贴壁细胞收到当天切忌立刻消化，请将细胞换液后放置培养箱孵育到第二天再做消化传代，请优先选择直径6cm的培养皿进行传代培养

3、如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时做好照片记录并联系实验室。【培养条件】" 详见细胞说明书

【传代方法】建议1:2-1:3 两天换液一次

【冻存条件】详见细胞说明书

【主要文献】请具体查阅相关发表文章

细胞传代培养的胰酶消化法：

传代培养：是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。传代细胞，可根据不同细胞采取不同的方法进行细胞传代。贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁的细胞用直接吹打或用硅胶软刮的刮除法传代。悬浮细胞可采用加入等量新鲜培养基后直接吹打分散进行传代，或用自然沉降法加入新培养基后再吹打分散进行传代。

实验步骤：① 入无菌室之前用肥皂洗手，再用75% 的酒精擦拭消毒双手;

② 倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液37℃下预热。

③ 超净台台面应整洁，用75%酒精棉球擦拭清洁;

④ 打开超净工作台的紫外灯照射台面20min左右，关闭紫外灯，打开风机清洁空气除去臭氧;

⑤ 点燃酒精灯;取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管;安上橡皮头;过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。

⑥ 将培养用液瓶口用75%酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

⑦ 倒掉培养细胞的旧培养基。NCM460正常结肠上皮细胞和培养基酌情可用2-3ml Hanks液洗去残留的就培养基，或用少量胰酶涮洗一下。

⑧ 每个大培养瓶加入1ml胰酶，小培养瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察。当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液中。

⑨ 加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7-10ml/大瓶;3-5ml/小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。盖好瓶盖，适度拧紧后稍回转，以利于CO2的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。

⑩ 对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。直接将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。

注意事项

① 传代培养时注意无菌操作并防止细胞间的交叉污染。所有操作尽量靠近酒精灯火焰。每次只进行一种细胞的操作。每种细胞使用一套器材。

② 每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。

③ 如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BBS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗生素，并经常更换培养基。

传代细胞的建系和维持：细胞系的维持通过换液传代再换液、再传代和细胞种子冻存来实现。

对每一个细胞系来说都有其自身的特点，要做好建系的维持必须记录好细胞档案,换液传代和做好细胞系的管理工作。

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