南京农业大学水稻抗病遗传育种课题组阐明水稻DNA依赖的RNA聚合酶V的重要生物学功能

　　7月22日，“作物遗传与种质创新国家重点实验室”的水稻抗病遗传育种课题组在《PNAS》在线发表了题为“The effect of RNA polymerase V on 24-nt siRNA accumulation depends on DNA methylation contexts and histone modifications in rice”的研究论文（Article）。

 

　　转基因是创制抗病优异种质，培育广谱、高抗作物新品种的一项重要现代生物技术。但是外来基因的导入常常引起作物的基因沉默，育种家有时需要从上百个转基因株系中认真比较，经过多代仔细筛选，才能挑选出稳定表达的转基因作物，这极大增加了转基因育种的工作量，延缓了培育作物新品种的周期。为了阐明水稻转基因沉默的分子机制，缩短水稻转基因育种年限，杨东雷课题组利用35S::OsGA2ox1转基因沉默的基础材料，采取EMS诱变的方式构建了转基因沉默的抑制子突变体库。从中筛选出上百个fem（five elements mountain） 突变体。本次发表的工作是关于fem3的，通过图位克隆他们发现FEM3编码DNA依赖的RNA聚合酶V（Pol V）的最大亚基。

 

　　他们发现Pol V, 或Pol IV, 或OsRDR2突变都造成水稻的雌雄配子不育，这表明RdDM（RNA-directed DNA methylation）这一基因沉默分子通路对于水稻的生殖发育极其重要。全基因组甲基化测序与分析发现，Pol V缺失后，lncRNA无法转录，从而造成全基因组特别是基因旁邻区域较短转座子上的CHH类型的DNA甲基化几乎全部丧失。小RNA测序与分析发现，水稻24-nt siRNA的合成几乎全部依赖于OsRDR2和Pol IV，但只是部分依赖于Pol V。进一步比较分析发现，在低CG甲基化、低CHG甲基化和高CHH甲基化的区域，24-nt siRNA合成依赖Pol V。而在高CG甲基化、高CHG甲基化和低CHH甲基化的区域，24-nt siRNA的合成不依赖于Pol V。详细分析DNA的碱基组成发现，24-nt siRNA的合成依赖于Pol V的区域含有较高的AT含量，而24-nt siRNA的合成依赖于Pol V的区域含有较高的GC含量。对osdrm2和osmet1两个突变体的甲基化组，siRNA转录组整合分析发现，在24-nt siRNA的合成依赖于Pol V的区域，CG甲基化与CHH类型的甲基化相互依赖，它们协同招募Pol IV-OsRDR2进而合成24-nt siRNA。这些24-nt siRNA的合成又反馈介导了DNA甲基化，形成siRNA-DNA 甲基化相互加强的闭环。

 

　　那么在24-nt siRNA的合成不依赖于Pol V的区域是什么因子招募Pol IV-OsRDR2进而合成24-nt siRNA呢？他们通过分析各种组蛋白修饰，发现激活型组蛋白修饰如H3K4ac, H3K9ac等在依赖于Pol V的24-nt siRNA区域富集，而抑制型组蛋白修饰H3K9me1和H3K9me2的丰度在不依赖于Pol V的24-nt siRNA区域较高。24-nt siRNA合成依赖于Pol V区域旁邻基因的转录水平明显高于不依赖于Pol V的24-nt siRNA旁邻基因的转录水平。这些研究结果说明依赖于Pol V的24-nt siRNA区域位于水稻的常染色质，而不依赖于Pol V的24-nt siRNA区域位于水稻的异染色质。

 

　　这项首次在水稻中进行的转基因沉默机制的系统研究，对于加速培育转基因作物提供了重要的理论指导。并且，这篇论文首次详细鉴定了单子叶植物Pol V的生物学功能，阐明了水稻中Pol V差异化调节siRNA合成的分子机制，为理解水稻表观基因组提供了新的认识。

 

　　论文第一作者单位与通讯作者单位均为南京农业大学。博士研究生郑克志为第一作者，博士研究生王莉莉和前沿交叉研究院曾龙军为该论文共同第一作者，杨东雷为唯一通讯作者。此外，农学院高夕全教授和福建农林大学郭忠新教授对该工作也有贡献。该研究得到了国家自然基金面上项目、转基因专项、江苏省自然基金杰出青年基金、“万人计划”－青年拔尖人才、江苏省现代作物生产协同创新中心等基金的资助，高通量测序数据分析工作在南京农业大学生物信息中心平台完成。

 

　　2015年，课题组负责人杨东雷作为高层次引进人才加入南农后，以水稻为研究作物，关注抗病信号转导、抗病与产量性状之间的互作。引进到南农后，研究成果以通讯作者或第一作者在 Nature Plants、PNAS、Cell Research、Molecular Plant、Cell Discovery、Plant Physiology等期刊上发表8篇SCI论文。2017年获得江苏省杰出青年基金，2019年入选南京农业大学钟山学者计划－青年学术骨干（B类）称号， 2020年获得中组部“万人计划”－青年拔尖人才资助。