12月16日,北京市农林科学院玉米DNA指纹及分子育种北京市重点实验室基因组编辑团队在Frontiers系列新期刊Frontiers in Genome Editing上发表题为“Genome engineering in plant using an efficient CRISPR-xCas9 toolset with an expanded PAM compatibility”的研究论文。该研究建立了基于SpCas9变体xCas9的基因敲除系统和胞嘧啶碱基编辑系统,成功将基因编辑的前间区序列邻近基序(PAM)范围拓展至GAD(D=A,T,G)和松弛型的NG,为在更广泛的基因组范围内选择基因编辑靶点提供了可能。
拓展CRISPR/Cas9核酸酶PAM范围是使其在植物中被更广泛应用的关键。2018年,David Liu团队在Nature上报道了一种能识别NG,GAA和GATPAM的SpCas9变体(xCas9)。2019年,多个实验室相继报道了xCas9在植物上的表现,发现其能够拓展基因组编辑范围至NGPAM位点,但对于GAA和GAT PAM 位点,在水稻T0苗中仅有一个GATPAM位点实现编辑被报道。而目前具有更大PAM范围的另一SpCas9变体(SpCas9-NG)在植物中和动物中都不识别GAA和GATPAM。因此,为了将基因组编辑范围拓展至GAA和GATPAM位点,植物中的xCas9基因编辑系统亟待优化和提高。
本研究通过使用tRNA连接强化sgRNA,形成高效的tRNA-esgRNA系统,开发出了基于xCas9的基因编辑系统 (CRISPR-xCas9),首次发现CRISPR-xCas9在植物中能够有效的切割GAAPAM位点和多个GATPAM位点,同时发现其还能够有效切割多个GAGPAM位点(动物中尚无报道),并且仍然保持编辑松弛型的NGPAM位点的能力。该研究进一步利用相似的载体结构开发了基于xCas9的胞嘧啶碱基编辑系统 (xCas9n-CBE),发现xCas9n-CBE在植物中可以对基因组上的以GA和松弛型的NG为PAM的靶点进行有效碱基编辑。本团队曾在2019年成功开发出基于xCas9的另一款新型碱基编辑器(xCas9-pBE),本研究开发的xCas9n-CBE与之相比,不但能够拓展编辑xCas9-pBE不能编辑的NGCPAM位点,而且表现出更高的平均碱基编辑效率和更宽的编辑窗口。除上述两款新型碱基编辑器外,本团队还在2019年开发出基于SpCas9及其变体VQR、以及SaCas9变体SaKKH的多款新型碱基编辑器,实现了对PAM 为NAG、NGA、NNMRRT及NNKRGT靶点的C至T碱基替换。综合应用这些具有不同特点的碱基编辑器,可以更大范围地拓展作物基因组上基因组编辑的可靶向区域,具有很大的应用潜力。
玉米中心张成伟博士为本文第一作者,杨进孝为本文通讯作者。本研究得到北京学者(BSP041)项目和北京市自然科学基金(6204041)资助。玉米基因组编辑团队是2017年组建成立的,目前主要聚焦于碱基编辑、精确替换、组学编辑及其在玉米和水稻等作物中的高效应用。这是该团队自成立以来在国际学术期刊上发表的第8篇高水平研究论文。