根据分析方法的目的，高效地进行液相色谱方法开发之几个基本概念

王中泰

根据分析方法的目的，高效地进行液相色谱方法开发之几个基本概念

HPLC 技术应用范围十分广泛，包括食品、医药、化工等领域。其分离、分析的高效，快速，定量准确，分析方法容易转移等特点，成为新药以及仿制药研发分析实验室不可或缺的一种基本仪器。而药物研发过程中，根据分析的目的不同，开发的液相分析方法亦多种多样，如 in-process-control ， impurity ， assay ， impurity indicating ， residual impurity ， genotoxic impurity control 等等。因此，需要针对分析方法目的的不同，选择特定的出发点，高效且快速的对分析方法进行开发。

1. 液相色谱系统有关基本概念
1.1 V0 ：死体积，其大小与仪器管路（进样器之后到检测器之前），色谱柱（未被固定相占据的色谱柱体积），检测器流通池以及进样器之后到检测器之前部分所有链接头处死体积有关，其中只有色谱柱内部分体积参与液 - 固分配平衡，其余部分均会导致无益的峰扩展。对应与色谱峰上的保留时间为死时间（ t0 ）；且 V0=t0 × F ， F 为流速。 t0 可以实际测定也可以通过估算得到（实际测定使用尿嘧啶，估算可将色谱图上第一个明显波动的保留时间计为 t0 或者通过 V0= （ 0.5Ldp2 ） /F 与 0.1L/F （仅应用于 4.6 mm 内径色谱柱）得到，第二种估算法一般小于实际测定值，第一种估算法有时由于强极性不保留组分共流出峰的峰扩展导致估算不准。但对于方法开发来说，估算方法的误差范围，完全可以接受）。

Figure 1 典型 RP 色谱图

1.2 Vd ：滞留体积， td × F ， td 为流动相变化前沿赶上色谱柱内组分的时间。其组成包括流动相泵混合器出口到色谱柱入口处的管路体积，各接口处的死体积，流动相 intial 组成到达色谱柱入口开始，至赶上溶质时流动相组成，这段时间内所流过的流动相体积。其大小将影响分析方法的有效转移，特别是对于 UPLC 而言，一般地，早流出组分色谱峰的保留时间受到较大影响，晚流出组分色谱峰受到的影响较小（以 RRT 计量）。

Figure 2 Vd 对保留时间的影响

Table 1 Vd 对保留时间的影响

Table 1 Vd 对保留时间的影响

严格来讲，滞留时间不仅与管路体积，各接头处体积有关，也与分析样品被保留能力以及梯度变化斜率直接相关，分析物被保留能力越弱、梯度斜率越大，其被影响程度也就越大（参照上表中各组分峰的相对保留时间）。因此在不同仪器之间进行方法转移的时候，需要重点考虑滞留体积对不同仪器之间方法重现性的影响。而在实际对 Vd 测量时，并不考虑溶剂变化前沿到溶质段时间流动相流过的体积（可结合梯度分离以及 Snyder 方程来理解），因此对于 Vd 的测定按照下图所示方法。

Figure 3 Vd 的测定方法图解

针对各 HPLC 系统具有不同的 Vd 值，依据仪器及软件功能，可采用两种措施来消除 Vd 不同对于液相色谱方法重现性的影响。其中一种是在色谱工作站软件中设置“进样开始后若干分钟开始梯度”或“梯度开始后若干分钟开始进样”。“进样开始后若干分钟开始梯度”方式，可能引起溶质在色谱柱前端多余的峰扩展，导致表观柱效略有下降，而“梯度开始后若干分钟开始进样”方式，则不会引入多余的色谱峰柱内扩展。另一种方式则是在方法开发时，梯度开始之前引入一定的等度时间（大于方法开发色谱系统以及方法待转移系统的滞留时间），该方式由于不依赖色谱工作站软件功能，因而具有很强的普适性与可操作性。

此外， V0 与 Vd 之间并无明确的大小关系，原因在于每一色谱系统的柱前管路体积以及柱后管路体积是不确定的，有的色谱系统 Vd 可能大于 V0 ，有的色谱系统 V0 可能大于 Vd 。

1.3 Snyder 方程，该方程经验性地总结了溶质在 RP 液相色谱系统中的容量因子与有机相比例之间的关系，其数学表达式为 lgK= lgKw - S ψ，其衍化形式为 lg(K1/K2 )= S △ψ。其中 K 为容量因子，数学表达形式为 K =(tR-t0)/t0 ，需要与固液分配系数 k 进行区分； Kw 为纯水相作为流动相时，溶质的容量因子； S 对于特定化合物为常数；ψ为有机相比例，以 % 计。容量因子的合理分布区间一般为 1-10 （ t0 一般为 0.5-2 min ，对应保留时间为 1-22 min ），保证分析物具有足够的保留时间的同时，保证方法运行总时间在可接受范围之内。

分析方法开发的目的不同，目标待分析物的容量因子的取值控制范围有所差别，有时将容量因子取值控制在 1-3 ，有时将其控制在 3-5 ，也有时将其控制在 5-10 。具体取值控制范围，应根据化合物的性质以及分析方法的用途来合理选择，保证既能满足分析方法需要，也尽量缩短运行总时间。

此外，容量因子与有机相的种类，添加剂， pH 等密切相关。 S 常数的大小与分析物的范德华分子体积，分析物与流动相之间偶极 - 偶极作用，分子诱导作用，氢键作用有关，一般分子量小于 500Da 时，其值一般为 3-5 （这也是等度分离条件下，有机相比例每减少 10% ，分析物的保留时间变为原来的 2-3 倍的理论依据所在）。

1.4 溶剂效应，是液相色谱分析方法开发以及应用过程中最常遇到的问题。特别是容量因子比较小的分析物的色谱峰最易出现溶剂效应。在 RP 色谱中，其色谱峰典型的特点为峰变宽，保留时间改变，峰形变差，色谱峰分叉，色谱峰变成色谱带甚至是出现两个单独的色谱峰等；在正相系统中，溶剂效应的典型特点为色谱峰变宽，色谱带伴随多个色谱峰顶点等。

Figure 4 溶剂效应引起的色谱峰分叉

Figure5 溶剂效应引起的色谱峰峰形变异

Figure 6 溶剂效应引起的色谱带柱内扩展

Figure 7 进样体积过大引起的溶剂效应

引起溶剂效应的原因有很多，如分析物极性过大而流动相 initial 组成中有机相比例偏高，溶剂的有机相组成高于流动相 initial 组成中有机相比例，进样体积过大，分析物具有多个 pKa （ pKb ）值等均可能引起溶剂效应。

引起溶剂效应的根本原因在于，分析样品注入色谱柱之后，由于溶解或稀释样品的溶剂与流动相组成之间存在极性，溶解性差异，导致分析物在溶剂以及流动相之间进行液 - 液分配直到平衡状态，部分取代了分析物在流动相与固定相之间的液 - 固分配平衡，正是由于分析物液 - 液分配不能瞬刻完成，引起了溶剂效应。

由于有机合成反应的溶剂一般为有机溶剂，未经稀释或使用不合理溶剂进行稀释，加入 DMF 或 DMSO 等助溶试剂等，极有可能引起溶剂效应。使用起始流动相组成作为溶剂可避免绝大多数的溶剂效应，但也有例外情况（如大极性多元酸性有机化合物使用纯有机相作为溶剂，在预调节流动相 pH 的条件下，则不会出现峰分叉甚至双峰的现象，而使用流动相则不然）。

1.5 pKa ，为酸离解常数，当流动相 pH 大于酸性化合物 pKa 值时，化合物本身解离，其极性极大提高；当流动相 pH 小于碱性化合物 pKa 值时，化合物本身被质子化，其极性极大提高。流动相 pH ，化合物 pKa 以及保留时间的关系如下图所示。

Figure 8 流动相 pH ，化合物 pKa 以及保留时间的关系

从上图，可以看出，当 pKa ± 2 的 pH 条件下，化合物绝大多数分子以一种状态存在。因此，对于酸性化合物分析方法的开发，为使化合物得到适当保留，流动相 pH 一般为 pKa-2 及以下，对于碱性化合物分析方法的开发，则宜选择 pH 为 pKa+2 以及以上，此种以调节流动相 pH 来实现化合物适当保留的方式，为典型的离子抑制反相液相色谱。

Reference

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