色谱柱孔径的选择及其对分析结果的影响

王中泰

色谱柱孔径的选择及其对分析结果的影响

孔径是指填料颗粒的孔或腔的平均尺寸，常见范围是100～300?，多孔色谱填料与目标物的作用绝大部分（＞95%）是发生在填料颗粒的内部，即孔内的，所以孔径对于色谱填料而言也是最重要的参数之一。一款填料孔径大小和孔径分布，在绝大多数的色谱分离纯化中，起到关键性作用。

? 大孔径的填料颗粒可以延长大分子溶质在填料表面的滞留时间，达到充分分离，改善峰形，所以大孔径填料适合分离大分子化合物或者水动力体积较大的分子。

? 较小孔径提供较高的表面积，可用于较大的载荷量，并保留小的有机化合物，可用于小分子有机物到聚合物的分离。

选择多大孔径的柱子是根据分子量的大小来确定的：

样品分子直径小于平均孔径才能进入微粒内部，通常孔径直径需要大于分子直径的3倍以上才不会对分析造成影响，所选色谱柱孔径至少是样品流体学直径的4倍。因此理论上来讲，分子量10000以下的化合物要用120?的柱子来分析，分子量大于1W小于20W的要用300?的来分析，分子量大于20W的就要用凝胶柱了。

而在实际色谱柱选择时，则一般按照以下方式选择：

分子量＜2000， 选择孔径80～180?；

分子量＞2000，选择孔径300?，300?全多孔色谱柱可用于分离蛋白质和多肽。

如果分子量太大，在填料为120?孔径的柱子上分离度会比较差。 因为样品分子在色谱柱上有较好的保留是因为可以进入到填料的微孔里面，与键合在微孔表面的C18长链相互作用。分子量太大无法进入填料微孔中，两相分配少分离度就会变差，同时会影响峰形。

应用案例

乳铁蛋白项目

客户使用月旭Xtimate? C4，120?色谱柱分析谱图如下：

色谱峰分叉，分析效果不理想。

乳铁蛋白分子量范围是：75000-80000，故改用色谱柱Ultimate? XB-C4，300?，分析谱图如下：

峰形良好。

结论：

色谱柱孔径的选择对分析结果存在一定影响，需要根据分析物的分子量大小来确定合适的孔径，以达到最优的分析效果。