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孔雀石绿检测试剂盒，采用间接竞争ELISA方法，同时把隐性孔雀石绿氧化成孔雀石绿，检测鱼、虾以及鱼池或鱼缸水样中的总的孔雀石绿（Malachite Green ，MG）。

1 原理及用途

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，同时把隐性孔雀石绿氧化成孔雀石绿，检测鱼、虾以及鱼池或鱼缸水样中的总的孔雀石绿（Malachite Green ，MG），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的孔雀石绿和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗孔雀石绿抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含孔雀石绿含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中孔雀石绿的残留量。

2 技术指标

2.1 试剂盒灵敏度：0.025ppb(ng/ml)

2.2 反应模式：25℃，30min～30min～15min。

2.3 检测下限：

水产样品、水样…………………………0.05ppb

2.4 交叉反应率：

显性孔雀石绿……………………………100%

隐性孔雀石绿……………………………<0.1%

结晶紫………………………………………95%

隐性结晶紫………………………………<0.1% 

2.5 样本回收率：

水产样品、水样…………………………70±18%

3 试剂盒组成

酶标板………………………………………96孔

标准品浓缩液（红盖）：100ppb……………1ml

酶标记物(红盖)………………………………11ml

抗体工作液(蓝盖)……………………………5.5ml

底物液A(白盖)………………………………6ml

底物液B(黑盖)………………………………6ml

终止液(黄盖)…………………………………6ml

20X浓缩洗涤液(透明盖)……………………40 ml

试剂A(黄盖)………………………………50 ml

试剂B(黄盖)………………………………50 ml

说明书 …………………………………………1份

4 需要的器材和试剂

4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 试剂：乙腈、浓盐酸、二氯甲烷、氯化钠、甲醇

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知：

    实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液：

配液1：乙腈-HCL混合溶液

    0.8ml浓盐酸加到1L乙腈中混合。

配液2：20% NaCl溶液

    25g NaCl 溶解到100ml蒸馏水中。

配液3：样本复溶液

    将试剂A 用去离子水按照1：1比例稀释后使用（1份试剂A+1份去离子水）。

配液4：样品稀释液

    按照3:28（3ml甲醇+28ml稀释后的试剂A）用于样本的复溶和标准液的稀释。(按需配制，现配现用)。

5.3 样本前处理步骤：

5.3.1 水产样本、水样处理方法

1）称取3±0.05g组织或3ml水样品于50ml离心管中，加入3ml 20% NaCl溶液，震荡2min ，加入8ml乙腈-HCL混合溶液，振摇3min，再加入 4ml二氯甲烷，充分震荡5min，15℃，4000r/min以上离心10min；

2）取3ml上清液，在56℃条件下氮气或空气流吹至完全干燥；

3）加入500µl样品稀释液，再加入500µl试剂B（混匀5秒后使用），充分复溶震荡混合，静置10～15min； 

3）取50 µl用于分析。

    样本稀释倍数:  2 

注：此方法所得到的结果为孔雀石绿；隐性孔雀石绿；结晶紫；隐性结晶紫的总量。 

6 酶联免疫试验步骤

将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

实验开始前需：

将20×浓缩洗涤液用去离子水按1:19稀释成工作洗涤液。

制备孔雀石绿标准液：（取一定量的100ppb标准品浓缩液在玻璃瓶中用样品稀释液稀释，现配现用。） 

标准液6（2.025ppb）：40.5ul标准品浓缩液（100ppb）加1959.5ul样品稀释液，混匀； 

标准液5（0.675ppb）：300ul标准液6加600ul样品稀释液，混匀；

标准液4（0.225ppb）：300ul标准液5加600ul样品稀释液，混匀；

标准液3（0.075ppb）：300ul标准液4加600ul样品稀释液，混匀； 

标准液2（0.025ppb）：300ul标准液3加600ul样品稀释液，混匀； 

标准液1（0 ppb）：直接用样品稀释液。

6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，再加抗体工作液50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡5秒混匀，25℃反应30分钟。

6.3 洗    涤：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，用吸水纸拍干。

6.4 加酶反应：加酶标记物100µl/孔，25℃避光反应30分钟。

6.5 洗    涤：同上

6.6 显    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟。

6.7 终    止：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，终止反应。

6.8 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应终止反应后在10分钟内完成。

7 结果分析

7.1 百分吸光率的计算

    标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

 百分吸光度值（%）＝ A ×100%

A0

A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值

7.2 标准曲线的绘制与计算

    以标准品百分吸光率为纵坐标，对应的标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准品的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。

    若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

8 注意事项

8.1 室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

8.3 混合要均匀，洗板要彻底，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。

8.5 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度的降低。不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8.7 反应终止液为稀硫酸，避免接触皮肤。

9 贮藏及保存期

储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，不要冷冻。

保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。

孔雀石绿检测试剂盒产品说明书！