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按照〉a href="//www.sqrdapp.com/law/show-189682.html" target="_blank">食品补充检验方法工作规宙/a>》，《植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定》食品补充检验方法已经国家食品药品监督管理总局批准，现予发布、/div>
特此公告、/div>
食品药品监管总局
2017??5?/div>
附件
植物蛋白饮料中植物源性成分鉴定BJS 201707
1 范围
本方法规定了食品核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分鉴定的实时荧光PCR方法、/div>
本方法适用于核桃露（乳）、杏仁露、果仁露等复合植物蛋白饮料中标识含有核桃源性成分、花生源性成分、杏仁源性成分、芝麻源性成分、榛子源性成分、大豆源性成分的检测及鉴定、/div>
2 原理
提取试样中基因组DNA，以DNA为模板，利用物种特异性引物及探针进行实时荧光PCR扩增检测，同时设置阳性、阴性及空白对照。根据扩增的Ct值，判定试样中是否含有该源性成分、/div>
3试剂和材斘/div>
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB 6682的要求。所有试剂均用无
DNA酶污染的容器分装、/div>
3.1核桃源性成分Jugr2基因检测用引物对序列为９/div>
核桃5端引物：5-CGCGCAGAGAAAGCAGAG-3
核桃3端引物：5-GACTCATGTCTCGACCTAATGCT-3
核桃探针?-FAM-TTGTGCCTCTGTTGCTCCTCTTCCC-TAMRA-3
3.2花生源性成分Ara b2基因检测用引物（对）序列为９/div>
花生5端引物：5-GCAACAGGAGCAACAGTTCAAG-3
花生3端引物：5-CGCTGTGGTGCCCTAAGG-3
花生探针?-FAM-AGCTCAGGAACTTGCCTCAACAGTGCG-Eclipse-3
3.3 杏仁源性成分Prudul基因检测用引物（对）序列为９/div>
杏仁5端引物：5-TTTGGTTGAAGGAGATGCTC-3
杏仁3端引物：5-TAGTTGCTGGTGCTCTTTATG-3
杏仁探针?-FAM-TCCATCAGCAGATGCCACCAAC- Eclipse-3
3.4芝麻源性成?S albumim mRNA基因检测用引物（对）序列为９/div>
芝麻5端引物：5-CCAGAGGGCTAGGGACCTTC-3
芝麻3端引物：5-CTCGGAATTGGCATTGCTG-3
芝麻探针?-FAM-TCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA-3
3.5榛子源性成分oleosin基因检测用引物（对）序列为９/div>
榛子5端引物：5-CCCCGCTGTTTGTGATAT-3
榛子3端引物：5-ATGATAATAAGCGATACTGTGAT-3
榛子探针?-FAM-TCCCGTTCTCGTCCCTGCGGT- Eclipse-3
3.6大豆源性成分Lectin基因检测用引物（对）序列为９/div>
大豆5端引物：5-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3
大豆3端引物：5-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3
大豆探针?-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC- TAMRA-3
3.7真核生物18SrRNA内参照检测用引物（对）序列为９/div>
内参?端引物： 5-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3
内参?端引物： 5-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3
内参照探针：5-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAAC- TAMRA-3
3.8 CTAB缓冲液：55 mmol/L CTAB?400mmol/L NaCl?0 mmol/L EDTA?00 mmol/L Tris＋/div>
?0%盐酸调节pH ?.0?21℃高压灭?0 min, 备用、/div>
3.9 蛋白酶K?0mg/mL、/div>
3.10苯酚：氯仿：异戊醇（体积比：25:24:1）、/div>
3.11 异丙醇、/div>
3.12 70%乙醇、/div>
3.13 Taq DNA聚合酶、/div>
3.14 dNTP混合液、/div>
3.15 TE缓冲液（Tris-HCl、EDTA缓冲液）?0mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）、/div>
3.16 10PCR缓冲液：200 mmol/L KCl?5 mmol/L MgCl2?00 mmol/L Tris-HCl（pH8.8）、/div>
4仪器和设夆/div>
4.1 组织研磨器、/div>
4.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计、/div>
4.3 恒温水浴锅、/div>
4.4 离心机：离心?2,000g、/div>
4.5 微量移液器（0.5L~10L?0L~100L?0L~200L?00L~1000L）、/div>
4.6 实时荧光PCR仪、/div>
4.7 涡旋振荡器、/div>
4.8 天平：感?.01g、/div>
5分析步骤
5.1 试样总DNA的提叕/div>
固体样品：将样品粉碎后称?.3~0.6 g，按下列方法提取DNA。也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA、/div>
液体样品：取1 mL 样品于Eppordorf管中，加? 倍体积的异丙醇，混合均匀，室温下沉淀5 min，室温下?2,500 rpm 离心5 min，弃去上清液。重复此操作一次。所得的沉淀用于提取DNA。可按下列方法提取DNA，也可用等效商品化DNA提取试剂盒提取DNA、/div>
?）将处理后的样品加入2 mL离心管中，加?00 L CTAB缓冲液和40 L蛋白酶K溶液，振荡混匀?5℃孵? h（过夜孵育更好） 期间每隔10 min振荡混匀：/div>
?）加?00 L的苯酚：氯仿：异戊醇?5:24:1），振荡抽提10 min，室温下?2,500 rpm 离心10 min：/div>
?）小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀?2,500 rpm 离心10 min：/div>
?）弃去上清液，用65℃预热的TE缓冲液溶解DNA：/div>
?）小心吸取上清，加入200 L氯仿：异戊醇?4:1），振荡抽提，室温下?2500 rpm 离心15 min：/div>
?）小心吸取上清液，加入等体积的异丙醇，振荡均匀?2,500rpm 离心10 min：/div>
?）弃去上清液，沉淀?0% 乙醇洗涤，离?min，晾干，溶于50LTE 缓冲液中、/div>
5.2 DNA浓度和纯度的测定
?L DNA溶液，使用核酸蛋白分析仪检测其浓度及质量，OD260/280值应?.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增、/div>
5.3 实时荧光PCR扩增
反应体系总体积为25L，其?0PCR缓冲?L，正反向引物?0mol/L）各1L，探针（10mol/L?L，dNTPs?0mol/L?L ，Taq DNA聚合酶（2.5U?.2 L，DNA模板?0-100ng/L?L，用灭菌去离子水补足至总体?5L。真核生物内参照的反应体系同上，仅替换相应的引物和探针。也可使用相应的商品化扩增试剂盒、/div>
反应参数?0 2min 95 15min 95 15s 60 1min 40个循环、/div>
5.4 实验对照
检验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以相应植物源物种提取的DNA为阳性对照，以已知不含该植物源的物种DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设置两个平行的反应体系、/div>
6结果判断与表?/div>
6.1 质量控制
以下条件有一条不满足时，结果视为无效９/div>
（a）空白对照：无FAM荧光信号检出；
（b）阴性对照：无FAM荧光信号检出；
（c）阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct?le;35.0：/div>
（d）内参对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值＜30.0、/div>
6.2 结果判定
（a）如Ct?le;35.0，则判定为被检样品阳性；
（b）如Ct?ge;40.0，则判定为被检样品阴性；
（c）如35.0＜Ct值＜40.0，则重复试验一次。如再次扩增后Ct值仍?5.0＜Ct值＜40.0，则判定被检样品可疑、/div>
6.3 结果表述
结果为阳性者，结合产品标识，表述为检出XX源性成?rdquo;、/div>
结果为阴性者，结合产品标识，表述为未检出XX源性成?rdquo;、/div>
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结果为可疑者，结合产品标识，表述为XX源性成分可?rdquo;、/div>
7防污染措於/div>
食品安全标准管理办法 (国家卫生健康委员会令?0?国家卫生健康委员会关于巴拉圭冬青叶（马黛茶叶）等9种“三新食品”的公告 (2023 ?0? 国家市场监督管理总局等部门关于发布人参等3种保健食品原料目录的公告 (2023年第57? 国家卫生健康委员 国家市场监督管理总局关于特殊膳食用食品中氨基酸管理的公告 (2023 ?1? 市场监管总局关于发布《企业食品安全管理人员监督抽查考核指南》《企业食品安全管理人员监督抽查考核大纲》的公告 (国家市场监督管理总局公告2024年第4? 市场监管总局办公厅关于打击食品中非法添加非甾体抗炎药品及其系列衍生物或类似物违法行为的通知 (市监稽发?023?23? 国家认监委秘书处关于加强强制性产品认证依据标准修订时指定实验室检测能力管理的通知 (认秘函?023?2? 中华人民共和国粮食安全保障法（主席令 第十七号（/A> 国家认监委关于强化强制性产品认证自我声明评价方式实验室检测质量主体责任的公告 (2023年第26?农业农村部决定对氧乐果、克百威、灭多威、涕灭威?种高毒农药采取禁用措 (农业农村部公 ?36?
检测过程中放置交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行、/div>
本方法负责起草单位：河北省食品检验研究院、/div>
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验证单位：中国食品药品检验研究院、北京市食品安全监控和风险评估中心、湖北省食品质量安全监督检验研究院、武汉食品化妆品检验所、河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国肉类食品综合研究中心、/div>
主要起草人：周巍、王爽、章晶晶、崔生辉、李永波、孙勇、/div>
地区９/font>| 食品伙伴网提供标准法规解读、舆情监控、合规咨询、申报注册等服务、br/>电询?535-2129301 QQ?891238009 |
实时把握 食品标法动?/span> 请扫码关?span class="color2">食品标法圇/span> |
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