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口蹄疫灭活疫苗内毒素和总蛋白测定法(中华人民共和国农业部公告?078?

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放大字体缩小字体2014-03-21 04:33:26 来源9a href="http://www.moa.gov.cn/govpublic/SYJ/201403/t20140321_3825096.htm" target="_blank" rel="nofollow">农业?/a> 浏览次数9span id="hits">1874
核心提示:复至室温,??.5ml离心管中分别精确加入100μl疫苗?00μl丙酮,充分混匀,室温放?0分钟,在4℃条件下,以15000g离心15分钟。吸弃液相,沉淀物用400μl丙酮洗涤2次,室温干燥?5分钟,加50μl去离子水复溶后,按附注进行检验。每毫升疫苗总蛋白含量应不高?00μg、/div>
发布单位
农业
农业?/div>
发布文号 农业部公告第2078叶/td>
发布日期 2014-03-12 生效日期 暂无
有效性状?/th> 废止日期 暂无
备注
  根据《兽药管理条例》和《兽药注册办法》规定,我部组织制定了口蹄疫灭活疫苗内毒素和总蛋白测定法,现予发布,自发布之日起执行、/div>
  特此公告、/div>
  附件?.口蹄疫灭活疫苗内毒素测定泔/div>
  2.口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法
  农业?/div>
  2014??2?/div>
  附件1
  口蹄疫灭活疫苗内毒素测定泔/div>
  吸取12 ml疫苗放入15 ml离心管中,置505℃水?0分钟,然后在4℃条件下,以15000 g离心10分钟,取水相5.0 ml,按现行《中国兽药典》一部附录进行检验。每头份疫苗中内毒素含量应不高于50 EU、/div>
  附件2
  口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法
  ?瓶疫苗恢复至室温,在3?.5ml离心管中分别精确加入100l疫苗?00l丙酮,充分混匀,室温放?0分钟,在4℃条件下,以15000g离心15分钟。吸弃液相,沉淀物用400l丙酮洗涤2次,室温干燥?5分钟,加50l去离子水复溶后,按附注进行检验。每毫升疫苗总蛋白含量应不高?00g、/div>
  附注:口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法
  1.方法与原琅/div>
  本法适用于口蹄疫病毒油佐剂灭活疫苗总蛋白含量检测。本法系福林酚法(lowry?,依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与C2+螯合形成蛋白质-铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼酸还原,产生蓝色化合物,同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的含量、/div>
  2.试剂与仪?/div>
  2.1试剂丙酮(分析纯)、无菌去离子水、商品化Lowry法改良试剂盒:/div>
  2.2设备酶标仪(全波长)?ldquo;?6孔板,卡介苗注射器,单通道和多通道移液器,涡旋震荡仪,酶标板振荡器等、/div>
  3.操作步骤
  3.1标准系列稀释液制备将商品化试剂盒内标准牛血清白蛋白?mg/ml母液),按下表依次稀释、br />

编号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

母液?mu;l(/p>

0

5

25

50

100

150

200

300

400

去离子水?mu;l(/p>

400

395

375

350

300

250

200

100

0

终浓度(g/ml(/p>

0

25

125

250

500

750

1000

1500

2000



  3.2检验疫苗处理取1瓶疫苗恢复至室温摇匀后,??.5 ml离心管中分别精确加入100l疫苗?00l丙酮,充分混匀,室温放?0分钟,在4℃条件下,以15000 g离心15分钟。吸弃液相,沉淀物用400l丙酮洗涤2次,室温干燥?5分钟,加50l去离子水复溶备用、/div>
  3.3反应板加样与读数
  3.3.1各取3.1稀释的各浓度牛血清白蛋白标准溶液40l,以及三重复待检疫苗样品40l,分别加入到96孔板内。用排枪迅速加?00l改良lowry法试剂盒内试剂,立即用振荡器混匀30秒;
  3.3.2封膜,室温孵?0分钟:/div>
  3.3.3各孔内分别加?0l 1倍酚试剂(试剂盒内为2倍,用前用去离子水现稀释),立即用振荡器混匀30秒;
  3.3.4封膜,室温孵?0分钟:/div>
  3.3.5酶标仪测?50nm吸光值,保存读数、/div>
  3.4数据处理
  根据系列标准蛋白稀释液的浓度(0g/ml?000g/ml)和750nm吸光值,使用EXCEL以吸光值为X轴,以蛋白标准浓度为Y轴,绘制标准曲线,依据趋势线求得多项式,其多项式R20.98、/div>
  将被检样品的吸光值代入标准蛋白获得的多项式,计算样品中蛋白含量,根据取样量求?ml样品中蛋白含量。例如口蹄疫灭活疫苗水相/油相比例?:1,免疫剂量为2ml时,100l疫苗经丙酮沉淀后用50l去离子水复溶,测得浓度即为每头份疫苗中蛋白浓度,?ml疫苗中蛋白浓度。结果判定时,将测定值除?即得每毫升疫苗中总蛋白含量、/div>
  3.5结果判定
  若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量小于或等于500g,则判定被检疫苗总蛋白含量符合规定;若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量大?00g,判定被检疫苗总蛋白含量不符合规定、/div>
  3.6检测数据处理举侊/div>
  3.6.1收集数据如表所礹br />

Value

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

0.102

0.149

0.336

0.504

0.836

1.122

1.334

1.702

1.923

--

--

--

B

0.677

1.722

0.252

1.116

2.167

1.020

--

--

--

--

--

--

C

0.640

1.704

0.230

1.050

2.195

0.962

--

--

--

--

--

--

D

0.641

1.716

0.225

1.061

2.175

1.012

--

--

--

--

--

--

E

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

F

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

G

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

H

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--

--


  上述表格中,A1-A9为系列稀释的标准牛血清白蛋白溶液,A1至A9蛋白浓度依次增高;B、C、D行中1-6列为检测样?50nm吸光值,B1-B6?批不同批次疫苗样品,每一列为同一疫苗样品三个重复、/div>
  3.6.2绘制标准曲线:将上表中数据复制到EXCELL表格中,

Value

1

2

3

4

5

6

7

8

9

OD750

0.102

0.149

0.336

0.504

0.836

1.122

1.334

1.702

1.923

蛋白浓度g/ml

0

25

125

250

500

750

1000

1500

2000


采用EXCEL程序,选中1-9列对应的两行数据插入散点?rdquo;,选择带平滑线和数据标记的散点?rdquo;,得到以750nm吸光值为X轴,以蛋白浓度为Y轴的曲线图。选择图表工具?ldquo;布局 趋势?rdquo;其他趋势线选项,选中多项?rdquo;?ldquo;显示公式?ldquo;显示R平方?rdquo;。通常R平方值大于等?.98表明标准曲线可信。每一?6孔板应设一组标准并绘制相应标准曲线、br />
  3.6.3数值计箖/div>
  以样品测定OD750值为X,代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423,Y为蛋白浓度,以表中第一批疫苗测定结果为例。该疫苗三重复测定的OD750数据(X)分别为?.677?.640?.641,代入公式计算蛋白含量(Y)分别为?34g/ml?06g/ml?07g/ml,该数据为每毫升水相抗原中总蛋白含量。计算三重复数值的平均值(AVERAGE)为316g/ml,标准差(STDEV.P)为13.1,变异系数为4.15%(标准差/平均?100%),将每毫升水相抗原中总蛋白含量,除以2折算为每毫升疫苗总蛋白含量,该疫苗的总蛋白含量为138g/ml。按照上述方法,可计算其他样品的总蛋白含量、/div>
  3.6.4结果判定
  同一样品不同重复间变异系数应小于5.3%,否则试验不成立,应重做。若测定值小于或等于500g/ml,则判定被检疫苗总蛋白含量符合规定;若测定值大?00g/ml,则判定被检疫苗总蛋白含量不符合规定、/div>
地区9/font>中国
标签9/font>农业检?nbsp;含量蛋白毒素
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