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分析方法学验证之(二):精密度和准确度

放大字体缩小字体发布日期:2024-01-23
核心提示: 分析方法的专属性和灵敏度是方法能够使用的前提,而精密度和准确度则是研发人员不断追求的目标。为什么这么说呢?接下来我
分析方法的专属性和灵敏度是方法能够使用的前提,而精密度和准确度则是研发人员不断追求的目标。为什么这么说呢?接下来我们就来简单说说方法的精密度(Precision)和准确度(Accuracy),看完之后可能你就会理解我的说法了。
首先为什么要把这两个放到一起来说?
就像方法验证中的定量限和检测限,精密度和准确度也是紧密相关的两个项目。良好的精密度是方法具有较好准确度的必要条件,但是良好的准确度还与其他因素(如基质干扰、溶液配制、结果计算等)有关。

接下来咱们来看它们具体的定义:
精密度:系指在规定的测定条件下,同一份均匀供试品,经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差(Deviation)、标准偏差(SD)或相对标准偏差(RSD)表示。
  • 在相同条件下,由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性;
  • 在同一实验室内的条件改变,如不同时间、不同分析人员、不同设备等测定结果之间的精密度,称为中间精密度;
  • 不同实验室测定结果之间的精密度,称为重现性。

准确度:准确度系指用所建立方法测定的结果与真实值或参比值接近的程度。一般用回收率(Recovery)表示。
  • 准确度应在规定的线性范围内试验。
  • 准确度可由所测定的精密度、线性和专属性推算出来。

那为什么说精密度和准确度是研发人员一个追求的目标呢?
首先:不是所有的方法都需要精密度和准确度的,比如定性方法。
其次:定义中可以看出来它们代表的都是一种接近程度。对于程度的探寻,它是永无止境的。
最后:我们需要了解方法验证的目的,除了证明方法满足预期用途之外,更重要的一点就是确认方法误差的来源和大小。方法的精密度和准确度取决于方法开发过程,因此它是一个研发人员追求的目标。

既然提到了误差,接下来咱们就说说方法的误差。
误差这个词相信大家都不陌生了。我们将分析结果与真实结果之间的差值称为误差。它是方法固有的,无法避免的。按照类型主要分为两类:
一)系统误差:它是由某种确定的原因引起的,一般有固定的方向(正或负)和大小,重复测定可重复出现。根据系统误差的来源,又可区分为方法误差、仪器误差、试剂误差及操作误差等。
  • 方法误差:由于分析方法本身的缺陷或不够完善所引起的误差。例如,在滴定分析法中,由于滴定反应进行不完全,或干扰离子的影响,导致终点判断不准确。
  • 仪器误差:由于所用仪器本身不够准确或未经校正所引起的误差。例如,砝码、滴定管刻度不够准确等。
  • 试剂误差:由于试剂不纯或含有杂质引入的误差。
  • 操作误差:由于操作人员的习惯而引起的误差。例如,读取滴定管的读数时偏高或偏低。
这类系统性误差(Systematic error)实际影响的是结果的真实性(Affect Trueness),即与真实值的偏离程度。
二)偶然误差:或称随机误差,它是由不确定的原因引起的,可能由于实验时环境的温度、湿度和气压的微小变化以及其他操作条件的微小波动所造成,其方向(正或负)和大小都不固定。
这类随机性误差(Random error)实际影响的是结果的精密度(Affect Precision),即数据间的离散程度。
因此,我们用一个等式来描述那就是:
注:偶然误差可以通过增加平行试验来减小;系统误差可以通过空白、对照和回收试验来校正。
讲到这,相信大家对准确度和精密度已经有了一个基本的认识了。准确度,它是一个综合的结果,它是所有误差相互作用后的最终体现。而精密度,它是通过统计学工具呈现出来的数据结果的偏差大小,主要是反映随机误差的影响。
这里为了便于大家理解,我们将准确度称为总体准确度(Overall Accuracy),它的含义是将测试样品制备的误差、基质的干扰以及结果计算的误差都考虑进去。即
基质的干扰指的是测试溶液中除目标物以外的所有成分(对于有关物质而言,其主成分、溶剂、其他杂质都是干扰基质),对目标物检测产生的干扰(如增强或抑制)。因此,这也是为什么在进行准确度验证的时候,法规指南推荐的方法是加标回收率,主要目的就是评估基质的干扰。
如下图所示,若线性溶液和准确度溶液配制的基质不同,往往会导致实际的标准曲线不同。我们在验证过程中需要注意不同溶液中的基质差异。
图片
精密度和准确度还受到样品取样、称量、定量稀释等溶液配制过程中的误差影响。换句话说,方法的精密度和准确度不会好于测试溶液制备的精密度和准确度。
举两个例子说明下这个问题:
1)我们准备将储备液稀释100倍,实验室使用的是A级的移液管和容量瓶,你觉得以下哪种方式是最准确的?
  1. 先1.0ml/10ml,再1.0ml/10ml
  2. 先5.0ml/50ml,再5.0ml/50ml
  3. 先10.0ml/100ml,再10.0ml/100ml
  4. 1.0ml/100ml
  5. 2.0ml/200ml
  6. 5.0ml/500ml

要回答这个问题,我们首先得知道A级移液管和容量瓶对应的允许误差(参考JJG196-2006),
仪器规格
容量允许误差
相对误差
1ml移液管
0.007ml
0.7%
2ml移液管
0.01ml
0.5%
5ml移液管
0.015ml
0.3%
10ml移液管
0.02ml
0.2%
10ml容量瓶
0.02ml
0.2%
50ml容量瓶
0.05ml
0.1%
100ml容量瓶
0.1ml
0.1%
200ml容量瓶
0.15ml
0.075%
500ml容量瓶
0.25ml
0.05%
因此,各步误差的总和(以最大误差来统计):
  1. 0.7%+0.2%+0.7%+0.2%=1.8%
  2. 0.3%+0.1%+0.3%+0.1%=0.8%
  3. 0.2%+0.1%+0.2%+0.1%=0.6%
  4. 0.7%+0.1%=0.8%
  5. 0.5%+0.075%=0.575%
  6. 0.3%+0.05%=0.35%
答案:f(从最准确的角度分析)
2)在滴定分析中,一般滴定管读数有±0.01ml 的绝对误差,同时一次滴定需要读数两次,因此可能造成的最大误差是±0.02ml。为使滴定读数的相对误差≤0.1%,那么消耗滴定剂的体积就需要≥20ml。
最后,我们再举个例子来说下计算方法对于准确度的影响。
如下图所示,当有关物质方法中杂质的相对响应因子(RRF)远小于1时,若我们计算结果不进行校正,直接采用主峰的线性来计算(如面积百分比计算),那么杂质的检测结果就会比实际含量低,导致杂质被低估。
关于计算方式的选择,这里我们简单地补充两点:
  • 对于是采用面积归一法还是自身稀释对照法,通常是在方法开发阶段将供试品稀释100倍来看下稀释后的溶液与原溶液是否成线性。若是,则可以用面积归一法;若不是,则建议使用自身对照法。
  • 对于是采用单点外标还是标准曲线法外标,主要是计算标准曲线的截距。若无明显截距(通常为不大于10%),则可以使用单点外标;若有明显截距,则建议使用标准曲线法。
此处需要特别说明的一点就是:验证过程中回收率计算方法应与检验方法一致。也就是说,如果检验方法中规定的是外标法,那么回收率计算时应采用外标法;如果检验方法中采用的是自身稀释对照法,则回收率计算时应采用自身稀释对照法;如果检验方法规定的是主成分外标法(个人比较推荐的方法),那么回收率计算时就应采用主成分外标法。否则,一律都按照外标法来计算回收率是没有意义的。
最后,我们再说下做法和要求(参考中国药典9101 分析方法验证指导原则):
1、精密度:
做法:
  • 在规定范围内,取同一浓度(分析方法拟定的样品测定浓度,相当于100%浓度水平)的供试品,用至少6 份的测定结果进行评价;
  • 设计至少3 种不同浓度,每种浓度分别制备至少3 份供试品溶液进行测定,用至少9 份样品的测定结果进行评价。
注意的是:采用第二种方法进行评价时,浓度的设定应考虑样品的浓度范围。
要求:
精密度的结果应报告标准偏差、相对标准偏差或置信区间。样品中待测定成分含量和精密度RSD可接受范围参考表3。
在基质复杂、组分含量低于0.01%及多成分等分析中,精密度限度可适当放宽。对于这个指导原则中的可接受标准,本文不做过多评论。但建议的是在国内申报时,大家还是能做到就尽量去做到。
2、准确度
做法:
  • 在规定范围内,取同一浓度(相当于100%浓度水平)的供试品,用至少6份样品的测定结果进行评价;
  • 设计至少 3 种不同浓度,每种浓度分别制备至少3份供试品溶液进行测定,用至少9份样品的测定结果进行评价,且浓度的设定应考虑样品的浓度范围。两种方法的选定应考虑分析的目的和样品的浓度范围。
同时,由于准确度一般用回收率来表示,我们以原料药的含量和有关物质为例来说下回收率的做法。
1)含量测定方法的准确度---直接回收率
原料药含量测定时,由于目标物通常为纯物质,可以直接用已知纯度的对照品或供试品进行测定,直接计算回收率=测得值/实际值,或用所测定结果与已知准确度的另一个方法测定的结果进行比较。当原料药为多组分时,也可以使用加标回收率来测定。
原料药的含量,线性范围一般为实际测定浓度的 80%~120%,其目的是考虑到这一范围足够可以满足《药典》中规定“约” 的定义为 90%~110%的范围;
2)有关物质测定方法的准确度---加标回收率
原料药有关物质测定时,主要需考察基质或其它物质的相互干扰,因此可向原料药中加入已知量的杂质对照品进行测定,计算回收率=(测得量-样品中的量)/加入量。如不能得到杂质对照品,可用所建立的方法与另一成熟方法(如药典标准方法或经过验证的方法)的测定结果进行比较。
有关物质的测定,实际操作的范围应该是定量限(或报告限)至雷竞技百科 标准的120%以上,同时需要进行主成分线性范围的测定(最高浓度为实际测定时稀释后的浓度的120%以上,最低浓度为定量限浓度),用于校正因子的测定。
要求:
对于化学药应报告已知加入量的回收率(%),或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差或置信区间(置信度一般为95%); 样品中待测定成分含量和回收率限度关系可参考表2。
同样的,在基质复杂、组分含量低于0.01%及多成分等分析中,回收率限度可适当放宽。
编辑:songjiajie2010

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关键词: 验证

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