柠檬酸杆菌的检验方法及结果判断

一、柠檬酸杆菌简介

柠檬酸杆菌（Citrobacter），革兰氏阴性兼性厌氧菌。直杆菌、直径约1.0μm，长2.0μm~6.0μm。有呼吸和发酵两种代谢类型。氧化酶阴性，动力试验、ONPG试验阳性，能利用柠檬酸盐，能够液化明胶，DNA酶试验和V-P试验阴性。根据《伯杰氏细菌学分类手册》，柠檬酸杆菌属分为弗氏柠檬酸杆菌（C.freundii）、科氏柠檬酸杆菌（C.diversus）和无丙二酸盐柠檬酸杆菌（C.amalonaticus）三个种。

二、参考标准；

《SN/T 2552.6-2010 乳与乳制品卫生微生物学检验方法 第6部分：柠檬酸杆菌检验》

三、检测步骤及结果判断

3.1 增菌

无菌称取样品100g，10g和1g各三份分别加入2000mL、250mL和100mL样品稀释瓶中，加入9倍预热到45℃的灭菌蒸馏水（1:10稀释），或者将样品直接称量到装有9倍预热到45℃的灭菌蒸馏水的样品稀释瓶中，振摇使样品充分混匀，36℃±1℃培养18h～24h。

分别移取培养18h~24h的悬液各10mL加入90mL四硫磺酸盐煌绿增菌肉汤（TTB）中，36℃±1℃培养18h～24h。

四硫磺酸盐煌绿增菌肉汤（TTB）检验原理：

蛋白胨和牛肉粉提供碳源、氮源和维生素，满足细菌生长的需求；氯化钠可维持均衡的渗透压；碳酸钙能中和细菌产酸及吸收有毒的代谢产物；硫代硫酸钠和四硫磺酸钠结合可抑制肠道共生菌（四硫磺酸钠是在培养基加入碘和碘化钾时形成），而具有四硫磺酸钠还原酶的细菌能在此培养基中繁殖；胆盐和煌绿可抑制大肠群菌和其它革兰氏阳性细菌。

四硫磺酸盐煌绿增菌肉汤（TTB）用法：

称取本品93.55g，溶解于1050mL蒸馏水中，加热煮沸，121℃高压灭菌15分钟，临用前加入20%碘液 20mL，0.1% 煌绿10mL，现配现用，不宜久置。培养结果如图1所示：

图1 弗氏柠檬酸杆菌在TTB中的培养结果

3.2 分离培养

轻轻混匀增菌液，每份增菌液用接种环接种沙门氏菌志贺氏菌分离琼脂（SS）平板、亚硫酸铋琼脂（BS）平板。采用三区法或四区法划线，以获得单个菌落。将平板倒置于36℃±1℃，SS琼脂平板培养18h～24h，BS琼脂平板培养40h～48h。

从SS平板和BS平板上分别挑取3个~5个可疑菌落，在营养琼脂斜面上纯化培养。柠檬酸杆菌在SS琼脂平板上的可疑菌落为圆形，粉红色、黑色、无色菌落，或粉红色、黑色中心菌落；在BS琼脂平板上的可疑菌落为棕绿色或棕黑色菌落。

SS琼脂培养基检验原理：

胨、牛肉浸粉提供碳源、氮源、维生素和矿物质；乳糖为可发酵的糖类；三号胆盐、枸橼酸钠和煌绿抑制革兰氏阳性菌及大多数的大肠菌群和变形杆菌；硫代硫酸钠和枸橼酸铁用于检测硫化氢的产生，使菌落中心呈黑色；中性红为pH指示剂，发酵糖产酸的菌落呈红色，不发酵糖的菌落为无色；琼脂是培养基的凝固剂。

SS琼脂培养基用法：

称取本品63.53g，溶解于1000mL蒸馏水中，加热煮至沸，不必高压蒸汽灭菌，冷至45℃-50℃倒成平板。培养结果如图2所示：

图2 弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864在SS琼脂平板上的培养结果

亚硫酸铋琼脂（BS）检验原理：

蛋白胨、牛肉粉在培养基中作为基础营养物质，为细菌生长提供所需的氮源、碳源、维生素及一些矿物质等元素；葡萄糖可作为细菌生长代谢所需的能量物质；磷酸盐对培养环境pH值起到缓冲作用。煌绿和亚硫酸钠能抑制大肠杆菌、变形杆菌和革兰氏阳性菌的生长。伤寒沙门氏菌及其他沙门氏菌能利用葡萄糖，将亚硫酸盐还原成硫化物并与铁反应使得菌落呈黑色，此外还可把铋离子还原成金属铋，使菌落呈现金属光泽，从而使沙门氏菌得到分离。

亚硫酸铋琼脂（BS）用法：

称取本品50.3g，加入1000 mL蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，冷至45℃-50℃，摇匀，倾入无菌平皿备用。无需高压灭菌。保存于黑暗处，48小时内使用。培养结果如图3所示：

图3 弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864在BS琼脂平板上的培养结果

3.3 分离鉴定

3.3.1 方法选择

对挑选的菌体进行革兰氏染色，氧化酶试验初步生化鉴定。革兰氏染色阴性，氧化酶试验阴性按3.3.2进行初步生化试验。革兰氏染色结果如图4A，氧化酶试验结果如图4B：

图4 弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864革兰氏染色结果，弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864氧化酶实验结果

3.3.2 初步生化鉴定

使用营养琼脂平板或斜面上纯化分离的新鲜培养物（培养时间不超过24h）进行动力试验、ONPG试验、柠檬酸盐试验、DNA酶试验（或明胶液化试验）和V-P试验。动力试验、ONPG试验和柠檬酸盐试验阳性，DNA酶试验（或明胶液化试验）和V-P试验阴性的菌落为柠檬酸杆菌属细菌。再次用营养琼脂纯化培养18h～24h后，进行后续生化试验。初步生化鉴定结果如图5所示：

图5 弗氏柠檬酸杆菌ATCC 43864初步生化鉴定结果

3.3.3 生化鉴定

使用营养琼脂上的新鲜培养物（培养时间不超过24 h）按表1各项生化试验进行柠檬酸杆菌各种的鉴定。确证鉴定结果如图6所示：

表1 柠檬酸杆菌属生化鉴定表

确证实验	弗氏柠檬 酸杆菌 （C.freundii）	科氏柠檬 酸杆菌 （C.diversus）	无丙二酸盐 柠檬酸杆菌 （C.amalonaticus）
水杨酸发酵产酸	﹣	V(﹣)	V
D-戊糖醇发酵产酸	﹣	＋	﹣
产硫化氢	V(＋)	﹣	﹣
鸟氨酸脱酸酶	V(﹣)	＋	＋
靛基质	﹣	＋	＋
丙二酸盐利用	V(﹣)	＋	﹣
注：＋：≥90%阳性；(＋)：75%~89%阳性；d：不同菌株不定；(﹣)：75%~89%阴性；﹣：≥90%阴性。

图6 弗氏柠檬酸杆菌确证生化鉴定结果

四、结果判定与结果报告

4.1 结果判定

4.1.1 柠檬酸杆菌属

革兰氏染色阴性，氧化酶实验阴性，生化反应符合3.3.2要求的菌落，判定为柠檬酸杆菌属细菌。

4.1.2 柠檬酸杆菌

革兰氏染色阴性，氧化酶实验阴性，生化反应结果与3.3.2和3.3.3中表1的生化反应结果相符，或根据生化鉴定试剂盒、生化鉴定系统鉴定到柠檬酸杆菌属的结果，可判定为特定的柠檬酸杆菌。

4.2 结果报告

生化鉴定结果符合柠檬酸杆菌生化特性，按增菌培养的阳性瓶数，应用MPN表，查出每100 g样品中的MPN值。检测结果报告为每100 g样品中柠檬酸杆菌（属或种）的MPN值。

表2 可能数（MPN）表（95%置信区间）

使用三管法，接种量分别为10.0 g，1.0 g和0.1 g。

阳性管数			MPN /100g	可信限		阳性管数			MPN /100g	可信限
10	1	0.1		低	高	10	1	0.1		低	高
0	0	0	＜3.0	-	9.5	2	2	0	21	4.5	42
0	0	1	3.0	0.15	9.6	2	2	1	28	8.7	94
0	1	0	3.0	0.15	11	2	2	2	35	8.7	94
0	1	1	6.1	1.2	18	2	3	0	29	8.7	94
0	2	0	6.2	1.2	18	2	3	1	36	8.7	94
0	3	0	9.4	3.6	38	3	0	0	23	4.6	94
1	0	0	3.6	0.17	18	3	0	1	38	8.7	110
1	0	1	7.2	1.3	18	3	0	2	64	17	180
1	0	2	11	3.6	38	3	1	0	43	9	180
1	1	0	7.4	1.3	20	3	1	1	75	17	200
1	1	1	11	3.6	38	3	1	2	120	37	420
1	2	0	11	3.6	42	3	1	3	160	40	420
1	2	1	15	4.5	42	3	2	0	93	18	420
1	3	0	16	4.5	42	3	2	1	150	37	420
2	0	0	9.2	4.4	38	3	2	2	210	40	430
2	0	1	14	3.6	42	3	2	3	290	90	1000
2	0	2	20	4.5	42	3	3	0	240	42	1000
2	1	0	15	3.7	42	3	3	1	460	90	2000
2	1	1	20	4.5	42	3	3	2	1100	180	4100
2	1	2	27	8.7	91	3	3	3	＞1100	420	-
注：如果接种量扩大10倍，分别为100.0g，10.0g和1g时，表中的数字相应缩小10倍。如果接种量缩小10倍，分别为1.0g，0.1g和0.01g时，表中的数字相应扩大10倍，其余类推。

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