GB 4789 菌落总数测定、金黄色葡萄球菌检验及霉菌和酵母计数 标准解读 （标准补充）！

portant; word-wrap: break-word !important;">GB 4789.2-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定

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portant; word-wrap: break-word !important;">一、称样：

portant; word-wrap: break-word !important;">（1）一般称量25g，由于称样量较大，标准中对于称样的准确性未作出明确规定，微生物室常用称样的电子天平最大允许误差为±0.1g，一般遵循“宜多不宜少”的原则，即实际称样时可根据样品情况称取超出25g（如硬质糖果等，检验人员应依据样品实际情况决定如何称样）；

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portant; word-wrap: break-word !important;">（2）对于部分食品添加剂已明确须称取1.0g的，则须严格精确称量。

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portant; word-wrap: break-word !important;">二、样品稀释：

portant; word-wrap: break-word !important;">（1）固体或半固体：称取25g样品于均质袋中，加入已灭菌的生理盐水225g，稍捏碎（特别是糕点/面包及其他淀粉制品），放入拍击式均质器均质1min，此时即制备成1：10的样品匀液。以移液器或灭菌吸取该液体至9mL灭菌生理盐水试管中，换上新的灭菌移液器枪头，缓缓吸取液体后反复吹打2次，此时即制备成1：100的匀液，以此类推，制备10倍系列稀释匀液。

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portant; word-wrap: break-word !important;">（2）液体样品：直接吸取原液进行检验，稀释时可直接吸取1mL原液到9mL灭菌生理盐水试管中按照“固体或半固体”的方式稀释。

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portant; word-wrap: break-word !important;">三、稀释度的选取：

portant; word-wrap: break-word !important;">液体样品可直接取原液进行检验；固体或半固体则必须依据检验经验，选取2-3个适宜稀释度进行检验（一般样品选取1：10，1：100，1：1000三个稀释度进行检验。若遇到不常做的样品，可适当延长稀释度至1：100000甚至1：1000000）。

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portant; word-wrap: break-word !important;">四、雷竞技百科 控制：

portant; word-wrap: break-word !important;">空白对照：分别吸取1mL灭菌生理盐水到平皿中做空白对照。（若空白有菌落生长则该实验无效）。

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portant; word-wrap: break-word !important;">五、平板计数琼脂（PCA）：

portant; word-wrap: break-word !important;">灭菌条件为121℃、15min。一般情况下于500mL敞口锥形瓶（三角瓶）中配制400mL/瓶。

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portant; word-wrap: break-word !important;">六、有时样品基质比较特殊，样品匀液有细小的颗粒与菌落不易区分，此时可采用如下方法进行区分：

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portant; word-wrap: break-word !important;">（1）配制1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液（又称红四唑或红四氮唑，简称TTC），高压灭菌后避光冷藏备用。红四唑灭菌条件为：121℃、20min；

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portant; word-wrap: break-word !important;">（2）待PCA琼脂培养基冷却至适宜倾注温度时，无菌加入上述TTC溶液2mL，充分摇匀（此时PCA中TTC浓度为0.005%）。

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portant; word-wrap: break-word !important;">加入TTC的目的及注意事项：培养后，菌落被TTC染成红色，而样品颗粒不变色，方便计数；PCA中TTC的浓度不宜过高，否则会抑制微生物的生长，对实验结果产生影响。（特殊情况下方添加TTC，常规实验无须添加，特别是对于菌落数量较少的样品不宜添加。方法来源依据为《化妆品卫生规范》中菌落总数测定相关章节）

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portant; word-wrap: break-word !important;">七、稀释液：

portant; word-wrap: break-word !important;">常采用0.85%氯化钠溶液（生理盐水），121℃、15min高压灭菌后冷却备用。

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portant; word-wrap: break-word !important;">八、倾注培养基时，根据对样品污染情况的估计（同一类型样品的微生物检测经验），若样品有表面蔓延生长的可能性，则待第一次倾注的琼脂凝固后，可在表面再覆盖一层琼脂以避免菌落蔓延而难以计数。

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portant; word-wrap: break-word !important;">九、水产品30±1℃培养72±3h；其它样品36±1℃培养48±2h。注意：此处的“水产品”是指生鱼片、鱿鱼干等未经深度加工的水产品。

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portant; word-wrap: break-word !important;">十、本标准的重难点为菌落计数及计算。

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portant; word-wrap: break-word !important;">除标准中已说明的要求外，有以下几点需要注意：

portant; word-wrap: break-word !important;">（1）菌落计数时，从低稀释度的平板开始计数。若所有平板上的菌落数均小于30CFU，则须计数所有平板上的菌落数，但仅采用最接近30CFU的两个平板的菌落数来计算最终菌落总数。

portant; word-wrap: break-word !important;">以固体样品举例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：

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portant; word-wrap: break-word !important;">（2）当第一稀释梯度一个板上菌落数高于30，另一个低于30，则依据标准应当以介于30-300之间的菌落数作为该稀释梯度的菌落数。（存在争议，实际遇到该类情况时应谨慎对待）

portant; word-wrap: break-word !important;">以固体样品举例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：

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portant; word-wrap: break-word !important;">（3）若所有平板上的菌落数均大于30CFU，则只计数30-300CFU之间的平板上的菌落数，并采用这些数据，依据标准中给定的公式，进行最终菌落总数的计算，此时将大于300CFU的记为“多不可计”，以“TNTC”表示。

portant; word-wrap: break-word !important;">以固体样品举例，根据标准中给定的公示，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：

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portant; word-wrap: break-word !important;">（4）若所有稀释度的平板菌落数都大于300，则不能所有都计为TNTC，必须将最高稀释度的两个平板上的菌落逐一地计数，再计算平均数，该平均数为该梯度的菌落总数，其余平板上的菌落数可记为TNTC。

portant; word-wrap: break-word !important;">以固体样品举例，菌落数选取、计算过程及结果修约如下：

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portant; word-wrap: break-word !important;">（5）计算菌落总数时，须严格按照标准要求进行计算。

portant; word-wrap: break-word !important;">特殊情况：

portant; word-wrap: break-word !important;">①若所有平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数。“最低稀释倍数”并不是固定不变的，与检验人员选取的稀释度有关。如：某样品多次检验后发现菌落总数较高，检验人员在梯度稀释后取1:1000、1:10000、1:100000三个梯度的稀释液倾注平板，最终所有平板上的均无菌落生长，则计算过程为＜1×1000，最终结果为＜1000CFU；若选取1:10、1:100、1:1000三个梯度的稀释液倾注平板，均无菌落生长，则最终结果为＜10CFU。因此，稀释度的选择对于结果存在较大影响，选择时应谨慎。

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portant; word-wrap: break-word !important;">②最低稀释度两个平板只有一个平板上长了1个菌落，若为固体样品且本次检验的最低稀释倍数为1:10，此时计算过程为（1+0）/2×10=5，由于默认固体样品最小检出量为10CFU，故本次检验的菌落总数结果为10CFU。注意：对于该情况一直存在争议，不同的检验人员可能做法不一，有人保留为5CFU，有人保留为10CFU，并无固定做法。（建议检验人员保持一贯做法，不要随意更改）

portant; word-wrap: break-word !important;">举例如下：

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portant; word-wrap: break-word !important;">十一、对于水产品、冷冻食品、速冻食品等菌落总数含量较高、限量值较大的食品类别，建议多增加稀释梯度（可稀释至10-4甚至10-5），避免稀释度较低、浓度较大导致培养后平板上菌落蔓延、弥散而难以计数甚至无法计数。

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portant; word-wrap: break-word !important;">GB 4789.10-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验

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portant; word-wrap: break-word !important;">第一法 金黄色葡萄球菌定性检验

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portant; word-wrap: break-word !important;">1、7.5%氯化钠肉汤增菌培养：

portant; word-wrap: break-word !important;">（1）若样品本身在均质后清澈，培养18h观察呈现一定程度的浑浊（与培养前相比），则接种平板；若18h后仍无变化，继续培养至24h后无论浑浊与否都接种至平板；

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portant; word-wrap: break-word !important;">（2）若样品本身在均质后浑浊，则直接培养至24h后再接种平板。

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portant; word-wrap: break-word !important;">2、血平板：36±1℃培养18h后观察，若有菌落生长或有菌落生长的迹象（无论是否溶血），则应酌情配制NA、BHI并分装至小试管中（NA 10mL/管、BHI 5mL/管）、灭菌后NA应斜放凝固成琼脂斜面备用。至血平板培养至24h取出，挑取菌落进行革兰氏染色镜检，同时挑取菌落接种至NA斜面、BHI肉汤管，36±1℃培养24h。

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portant; word-wrap: break-word !important;">3、接种原则：

portant; word-wrap: break-word !important;">（1）革兰氏染色后还剩余10个或10个以上菌落，则NA、BHI分别接种5管；

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portant; word-wrap: break-word !important;">（2）若多于5个（不包括5个）不足10个，则BHI接种5管，剩余的接种NA；

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portant; word-wrap: break-word !important;">（3）5个及以下则全部接种BHI，不接种NA。

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portant; word-wrap: break-word !important;">4、BP平板：36±1℃培养24h后观察，有菌落生长则取出，无菌落生长则继续培养至48h后再观察。若血平板已挑取菌落进行证实试验，则不必再挑取BP平板上的菌落进行实验。 若血平板上无菌落生长，则应在24h～48h内逐步观察BP平板是否长菌或有无长菌迹象，有则需配置BHI及NA，挑取BP上的菌落进行纯化、增菌，36±1℃培养24h。

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portant; word-wrap: break-word !important;">5、血浆凝固酶试验：

portant; word-wrap: break-word !important;">（1）根据BHI管数，取冻干血浆粉，每瓶用移液枪加入0.5mL生理盐水，使其充分溶解，再换移液枪枪头取0.3mLBHI培养物加入其中（每管BHI用1个枪头），振荡摇匀后于36±1℃培养，计时，每30min观察一次，如呈现凝固（将试管倾斜或倒置时出现凝块）或半凝固（一般的液体呈现凝固）则判定为阳性。若一直不凝固，则一直观察，直至观察至6h（查看12次）还未凝固，则试验终止，判定为阴性结果；若中途出现完全凝固或半凝固，则试验终止，判定为阳性结果。

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portant; word-wrap: break-word !important;">（2）同时取金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC 6538以及CMCC（B）26003各一支）制成菌悬液后作为阳性对照、以灭菌生理盐水为阴性对照，分别接种至BHI中同步培养后进行血浆凝固酶试验。

portant; word-wrap: break-word !important;">（3）若血浆凝固酶试验结果可疑，则挑取NA上的菌落接种BHI再次进行试验。

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portant; word-wrap: break-word !important;">第二法 金黄色葡萄球菌平板计数法

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portant; word-wrap: break-word !important;">1、取1mL样品稀释匀液接种3个BP平板（此处并未严格按照标准中0.3mL、0.3mL、0.4mL精确取样，由于如此操作会增加试验时间，无法在15min内完成试验）。

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portant; word-wrap: break-word !important;">2、涂布时不要触及平板边缘（会导致样液涂抹不均匀，大部分汇集于边缘）。

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portant; word-wrap: break-word !important;">3、可用同一根涂布棒从低稀释度到高稀释度进行涂布（不用换涂布棒）。

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portant; word-wrap: break-word !important;">4、涂布完成后应稍微放置一段时间使培养基吸收样品匀液。

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portant; word-wrap: break-word !important;">5、若水珠较多，可正置于培养箱中1～2h后再倒置培养。

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portant; word-wrap: break-word !important;">6、36±1℃培养24h后观察，有典型菌落生长则进行证实试验（革兰氏染色镜检、血浆凝固酶试验、划线血平板）。若无菌落生长则继续培养至48h后再观察，有典型菌落生长则进行证实试验，无典型菌落生长则试验终止。

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portant; word-wrap: break-word !important;">第三法 金黄色葡萄球菌MPN计数法

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portant; word-wrap: break-word !important;">1、样品稀释同菌落总数，取3个连续稀释度稀释液（或包括液体样品原液），每个稀释度接种3管7.5%氯化钠肉汤，每管接种1mL，36±1℃培养18h后观察，若出现浑浊则接种至BP平板，若无变化则继续培养至24h后再接种至BP平板。

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portant; word-wrap: break-word !important;">2、划线接种至BP平板，36±1℃培养24h后观察，有典型菌落生长则进行证实试验（革兰氏染色镜检、血浆凝固酶试验、划线血平板）。若无菌落生长则继续培养至48h后再观察，有典型菌落生长则进行证实试验，无典型菌落生长则试验终止。

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portant; word-wrap: break-word !important;">3、根据证实后的阳性管数差MPN表得出结果。

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portant; word-wrap: break-word !important;">GB 4789.15-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数

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portant; word-wrap: break-word !important;">第一法 霉菌和酵母平板计数法

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portant; word-wrap: break-word !important;">1、孟加拉红培养基灭菌条件比较特殊：121℃，20min。

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portant; word-wrap: break-word !important;">2、稀释液可选择生理盐水、磷酸盐缓冲液，还可选择无菌水。

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portant; word-wrap: break-word !important;">3、正置平板培养。为避免孢子扩散、菌落蔓延，可选择使用一次性塑料培养皿。

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portant; word-wrap: break-word !important;">4、“观察并记录培养至第5d的结果”，意味着需要从培养的第二天开始逐日观察并记录霉菌和（或）酵母的生长情况，且原始记录须体现“逐日观察”。

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portant; word-wrap: break-word !important;">5、特别注意：“菌落数在10以内时，采用一位有效数字报告，菌落数在10～100之间时，采用两位有效数字报告”，即：在直接吸取原液检验时，若两个平板上的平均菌落数小于10，则四舍五入后的数值直接记为最终结果（不可四舍五入为10），若1：10的两个平板上一个长1个菌落，另一个无菌落生长，则平均数为0.5，最终计算结果为5，结果报告为5，而不是10。

portant; word-wrap: break-word !important;">为防止孢子蔓延污染霉菌培养箱，可每周用75%酒精擦拭消毒两次或每次检出霉菌时用杀孢子剂消毒。