微生物保藏方法之定期移植保藏法

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A.1　适用范围 本方法适用于大多数细菌和真菌。
A.2　原理 低温条件下保藏可减缓微生物菌种的代谢活动，抑制其繁殖速度，达到减少菌株突变，延长菌种保藏时间的目的。 保藏培养基一般含较多有机氮，糖分总量不超过2%，既能满足菌种培养时生长繁殖的需要，又可防止因产酸过多而影响菌株的保藏。
A.3　技术要求
A.3.1　不同菌种应根据要求选择合适的培养基。
A.3.2　接种时要求无菌操作，避免染菌。
A.3.3　保藏期间要定期检查菌种存放的房间、冷库、冰箱等的温度、湿度，各试管的棉塞有无污染现象，如发现异常应取出该管，重新移植培养后补上空缺。
A.3.4　大量菌种同时移植时，各菌株的菌号、所用培养基要进行核对，避免发生错误。
A.3.5　每次移植培养后，应与原保藏菌株和菌株的登记卡片逐个对照，检查无误后再存放。
A.3.6　斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。
A.4　方法与步骤
A.4.1　培养基制备
A.4.1.1　器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，根据不同情况洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
A.4.1.2　溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量。
A.4.1.3　调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸或稀碱调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
A.4.1.4　加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
A.4.1.5　过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装，斜面培养基不宜超过试管高度的四分之一。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
A.4.1.6　包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
A.4.1.7　灭菌 根据要求将培养基灭菌。灭菌后摆放斜面时，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
A.4.1.8　无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验。
A.4.2　接种
A.4.2.1　斜面接种
A.4.2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
A.4.2.1.2 中央划线 从斜面中部自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。
A.4.2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。
A.4.2.1.4 密波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。
A.4.2.1.5 挖块接种法 挖取菌丝体连同少量琼脂培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。
A.4.2.2　穿刺接种 用直接种针从原菌种斜面上挑取少量菌苔，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。适用于细菌和酵母菌等。
A.4.2.3　液体接种 挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。
A.4.3　培养 将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。
A.4.4　保藏
A.4.4.1　保藏温度和时间 培养好的菌种于4℃－6℃保存，根据要求每3－6个月移植一次。对于某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须1－3个月移植一次。
A.4.4.2　保藏湿度 用相对湿度表示，通常为50%－70%。测量仪表采用毛发湿度计或干湿球湿度计。
A.4.5　移植培养 将培养物转接到另一新鲜培养基中，再在适宜条件下培养。
A.4.6　菌种复壮 菌种如有退化，应将退化的菌种引入原来的生活环境中令其生长繁殖，通过纯种分离，在宿主体内生长等方法进行复壮。
参考文献：
[1] 中国科学院微生物研究所. 菌种保藏手册[M]. 北京：科学出版社，1980
[2] 杜连祥. 工业微生物学实验技术[M]. 天津：天津科学技术出版社，1992
[3] 诸葛健，王正祥. 工业微生物实验技术手册[M]. 北京：中国轻工业出版社，1994
[4] 杜连祥. 乳酸菌及其发酵制品生产技术[M]. 天津：天津科学技术出版社，1999
[5] 姜成林，徐丽华.微生物资源学[M]. 北京：科学出版社，1997